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苏云金芽孢杆菌中脂肽类抗生素Iturins的研究

作　者: 郭丽清
导　师: 关雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苏云金芽孢杆菌 PCR 脂肽类抗生素抗菌作用 HPLC
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

多种芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质,包括非核糖体合成的脂肽类抗生素(lipopeptide antibiotics)生物表面活性素(surfactin)、丰原素(fengycin)和伊枯草菌素(iturin)等。其中的iturin家族类抗生素在农业、生物防治、医学等方面得到越来越广泛的应用。本研究尝试利用PCR、真菌抑制实验和HPLC等三种方法来鉴别生产iturin的菌株,以期从与枯草芽孢杆菌亲缘关系相近但目前尚未发现产iturin家族类抗生素的苏云金芽孢杆菌中发现生产iturinA等具有抗菌作用的脂肽类抗生素的菌株。利用GenBank上已登录的ituD序列设计引物,以本实验室保存的苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌等菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,获得了9株PCR阳性菌株。对克隆得到的ituD基因进行测序及Blast序列分析,结果表明,所克隆的基因与GenBank上已登录iturin家族脂肽抗生素的基因具有95%以上的同源性。对这9株菌株的的发酵液经过酸沉淀、甲醇抽提等步骤获得脂肽类粗提物,并进行抑制香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、黄瓜枯萎病菌( Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)和水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)等常见植物病原真菌的测定。结果表明,所提取的脂肽类粗提物中,枯草芽孢杆菌EPL8、解淀粉芽孢杆菌TB2对4种真菌菌丝生长均有较强的抑制作用,枯草芽孢杆菌BS1对Colletotrichum musae和Botrytis cinere菌丝生长有抑制作用,而苏云金芽孢杆菌BRC-XQ16则对Colletotrichum musae菌丝生长具有抑制作用。将对部分真菌菌丝具有抑制作用的这4株菌的脂肽粗提物纯化后经过反相HPLC分析,结果表明,EPL8和TB2脂肽类提取物中,峰值最高的3个组分与iturinA标准样品有相对应的接近的峰,据此推测EPL8和TB2中的脂肽类提取物中可能存在与iturinA结构类似的组分。BS1的脂肽提取物中峰值最高的组分保留时间几乎与iturinA标准样品中的同样峰值最高的保留时间相一致,据此推测该组分很可能就是iturinA标准样品中含量最高的组分。BRC-XQ16中峰值最高的2个组分保留时间与iturinA标准样品中的前2个组分保留时间相近,同样推测,BRC-XQ16中的这2种组分结构也类似iturinA。根据实验推测,本实验中的EPL8、TB2、BS1和BRC-XQ16共4株菌株可产生iturinA或者与iturinA结构类似的其他iturin家族成员。这一实验结果为这些菌株中产生的脂肽类抗生素的进一步的结构测定奠定了基础,也为拓宽苏云金芽孢杆菌的应用奠定基础。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
引言  11-26
  1 国内外Bt 研究进展  12-13
    1.1 苏云金芽孢杆菌的研究概况  12-13
    1.2 苏云金芽孢杆菌的应用概况  13
  2 芽孢杆菌中脂肽类抗生素的研究历程  13-16
    2.1 脂肽类抗生素的发现  13-14
    2.2 脂肽类抗生素的合成机制  14-15
    2.3 生物表面活性素（Surfactin）  15-16
    2.4 丰原素（Fengycin）  16
  3 伊枯草菌素（Iturin）的国内外研究现状  16-25
    3.1 Iturin 的研究概述  16-17
    3.2 Iturins 的合成与结构  17-20
    3.3 Iturins 的抑菌机理  20-22
    3.4 Iturins 的提取及分子结构鉴定  22-23
    3.5 Itruins 抑制真菌活性的测定  23
    3.6 Iturins 的应用  23-25
  4 本研究的目的及意义  25-26
材料与方法  26-35
  1 材料  26-29
    1.1 供试菌株  26-27
    1.2 培养基  27-28
    1.3 质粒载体  28
    1.4 酶与试剂  28-29
  2 实验方法  29-35
    2.1 细菌培养  29
    2.2 总DNA 的提取  29-30
    2.3 ituD 基因克隆  30-32
    2.4 菌体培养和脂肽粗提物的制备  32-33
    2.5 脂肽粗提物的抑菌活性检测  33
    2.6 反相HPLC 分离纯化  33-35
结果与分析  35-45
  1 ituD 的PCR 结果  35
  2 生物信息学分析  35-39
    2.1 苏云金芽孢杆菌XQ16 的比对结果  36-37
    2.2 枯草芽孢杆菌EPL8 的比对结果  37
    2.3 枯草芽孢杆菌 BS1 的比对结果  37-38
    2.4 解淀粉芽孢杆菌 TB2 的比对结果  38-39
  3 脂肽类粗提物的抑菌效果  39-42
    3.1 脂肽类粗提物对真菌菌丝生长的抑制作用  39-42
    3.2 脂肽类粗提物对部分真菌菌丝生长的抑制率  42
  4 脂肽类化合物的反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析  42-45
小结与讨论  45-48
  1 运用PCR 扩增及测序方法快速筛选可能产iturins 的菌株  45
  2 脂肽类抗生素抑制真菌活性  45-46
  3 RF-HPLC 分析脂肽类化合物  46-47
  4 小结  47-48
参考文献  48-56
致谢  56

苏云金芽孢杆菌中脂肽类抗生素Iturins的研究

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