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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）花芽几丁质酶基因克隆与植物表达载体构建

作　者: 谢东丽
导　师: 陈伟
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物学
关键词: 龙眼几丁质酶 RACE 载体构建
分类号: S667.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国重要和特色的亚热带果树,80年代以来,成花逆转被认为是导致龙眼大小年结果的主要原因之一。虽然传统的生理生化方法对这一问题的解决起到了一定的作用,但从分子水平上阐述龙眼成花逆转的机理、克隆相关基因以及利用基因工程手段抑制龙眼成花逆转也已成为研究方向之一。cDNA-AFLP分析发现几丁质酶片段在成花逆转的花芽中上调表达。作为一种病程相关蛋白,植物几丁质酶主要在植物抗病性方面起重要作用,但是一些研究表明植物几丁质酶还可能参与了发育调控、营养生长、器官的脱落等等,所以有必要深入研究龙眼成花逆转中的几丁质酶。主要研究结果如下:1.采用透射电镜分析了龙眼正常成花与成花逆转的花芽,结果表明成花逆转的花芽出现细胞壁的溶解,内质网增加,膜内折变形等,这些变化与叶片、花器官等脱落过程中所发生的变化基本一致。2.采用RACE方法成功的克隆了龙眼几丁质酶基因DLchi (GenBank登录号:GU177464),序列分析表明:DLchi cDNA全长为961bp,编码一个含227个氨基酸的开放阅读框。经过相关软件分析,推测其等电点和分子量分别为5.17和24.77 kD;其氨基酸与甜橙(Citrus sinensis)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、东方山羊豆(Galega orientalis)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、欧洲葡萄(Vitis vinifera)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、菜豆(Phaseolus vulgaris)的几丁质酶序列分别有74%、71%、69%、67%、68%、67%、65%、63%同源性;该蛋白具有几丁质酶19家族的催化区,无几丁质结合区及铰链区,根据传统的分类方法该蛋白属于class II几丁质酶;该蛋白以前体形式存在,含25个氨基酸的信号肽,蛋白成熟位点在S25-Q26之间;无跨膜信号,说明其分泌到细胞质中;从整体上看其为一疏水性蛋白,总平均亲水性为-0.217;二级结构预测结果表明α-螺旋和随机卷曲是该蛋白中最大的结构元件。除此之外,DLchi氨基酸序列还有一些活性位点,如N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、ATP/GTP-结合位点motif A (P-loop),尽管它们的具体功能不是很清楚,推测其可能参与信号转导。3.利用植物双元表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子可构成完整表达框的原理,将DLchi的ORF插入到pBI121载体中,成功构建了植物正反义表达载体,再通过冻融法将重组表达载体导入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的花浸法将DLchi基因导入模式植物拟南芥中,为进一步的研究奠定一定的基础。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
英文缩写词  12-14
氨基酸简写符号  14-15
第一章文献综述  15-35
  1 前言  15-17
    1.1 龙眼成花逆转的解剖学基础  15-16
    1.2 龙眼成花逆转的生理与分子基础  16
    1.3 影响龙眼花芽形成的因素及调控  16-17
    1.4 研究目的及意义  17
  2 植物几丁质酶研究进展  17-24
    2.1 几丁质酶的基本性质  18
    2.2 几丁质酶的分类  18-19
    2.3 生物学功能  19-23
      2.3.1 参与植物抗胁迫反应  19-21
      2.3.2 参与共生固氮作用  21-22
      2.3.3 参与植物的发育调控  22-23
      2.3.4 与营养生长有密切的关系  23
      2.3.5 与细胞壁相关的作用  23
    2.4 应用：主要是通过基因工程改善植物的抗病特性  23-24
    2.5 展望  24
  3 全长基因克隆方法的研究进展  24-35
    3.1 RACE 技术发展的背景  24-25
    3.2 RACE 技术的优化与改良  25-35
      3.2.1 反转录  25-26
      3.2.2 末端转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 加尾反应  26-33
      3.2.3 PCR 的扩增  33-35
第二章龙眼花芽透射电镜分析、DLchi 基因克隆及植物表达载体构建  35-70
  1 龙眼花芽透射电镜分析  35-38
    1.1 试验材料  35
      1.1.1 植物材料与试剂  35
      1.1.2 试剂配制  35
    1.2 试验方法  35-36
    1.3 结果与分析  36-38
  2 龙眼成花逆转相关基因DLchi 的克隆及序列分析  38-60
    2.1 试验材料  38-41
      2.1.1 植物材料采集  38
      2.1.2 菌株和载体  38
      2.1.3 生化及分子生物学试剂  38
      2.1.4 引物  38-39
      2.1.5 主要试验仪器  39-40
      2.1.6 试剂配制  40-41
    2.2 试验方法  41-48
      2.2.1 龙眼花芽总RNA 提取  41-42
      2.2.2 3’-RACE PCR  42-43
      2.2.3 5’-RACE PCR  43-45
      2.2.4 mRNA 全长获得  45
      2.2.5 半定量RT-PCR  45-46
      2.2.6 PCR 产物的回收和纯化  46
      2.2.7 回收产物与pMD18-T 载体连接  46-47
      2.2.8 大肠杆菌转化  47
      2.2.9 转化体的鉴定  47-48
      2.2.10 序列分析  48
      2.2.11 蛋白性质分析  48
    2.3 结果与分析  48-60
      2.3.1 RNA 质量分析  48-49
      2.3.2 3’-RACE PCR 扩增结果  49
      2.3.3 5’-RACE PCR 扩增结果  49-51
      2.3.4 mRNA 全长获得  51-53
      2.3.5 序列分析  53-57
      2.3.6 蛋白性质分析  57-60
      2.3.7 DLchi 表达分析  60
  3 DLchi 基因植物表达载体构建  60-67
    3.1 材料  61-62
      3.1.1 菌株与质粒  61
      3.1.2 试剂配制  61-62
    3.2 试验方法  62-65
      3.2.1 正反义片段的扩增  62
      3.2.2 正反义片段的制备  62-63
      3.2.3 双元载体 pBI121 的制备  63-64
      3.2.4 正反义表达载体的构建  64
      3.2.5 冻融法转化农杆菌  64-65
      3.2.6 农杆菌中质粒的鉴定  65
    3.3 结果与分析  65-67
      3.3.1 正反义片段的获得  65-66
      3.3.2 正反义载体的构建及在农杆菌中的鉴定  66-67
  4 初步建立DLchi 基因转化拟南芥体系  67-70
    4.1 试验材料  67-68
      4.1.1 植物材料  67
      4.1.2 培养基配制  67-68
    4.2 试验方法  68-69
      4.2.1 拟南芥苗的培养  68
      4.2.2 浸花法转化拟南芥  68-69
      4.2.3 转基因拟南芥的Kan 筛选  69
    4.3 结果与分析  69-70
第三章讨论  70-74
  1 龙眼花芽透射电镜分析  70
  2 DLchi 基因RACE PCR  70-72
    2.1 DLchi 基因的分类  70
    2.2 RACE 试验  70-72
      2.2.1 高纯度RNA 的提取对RACE 克隆来说是很关键的一步  70-71
      2.2.2 引物设计遵循原则  71
      2.2.3 尽可能优化体系，防止杂带污染  71-72
  3 表达载体构建  72
  4 拟南芥转化  72-73
  5 功能预测  73-74
参考文献  74-87
致谢  87

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）花芽几丁质酶基因克隆与植物表达载体构建

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