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PCV2 ORF2/PPV VP2核酸疫苗的构建及猪IFN-γ对其分子佐剂效应的研究

作　者: 陈燕凌
导　师: 徐志文；郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪细小病毒 猪圆环病毒 VP2基因 ORF2基因 干扰素-γ
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


猪细小病毒(Procine parvovirus, PPV),属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属的成员,是引起母猪繁殖障碍(reproductive failure)的主要病原体之一。各种不同类型的猪均可感染,引起母猪发生流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等。猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2, PCV-2)是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,临床表现为进行性消瘦,皮肤苍白或黄疽。目前这两种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍,给养猪业造成了巨大的经济损失,因此,为了预防和控制这些疾病,安全、高效的疫苗是首要的解决途径。干扰素-γ(IFN-γ)在免疫调节中其重要作用,它能激活巨噬细胞、上调MHCI、Ⅱ类分子表达水平和促进抗原提呈,诱导Th细胞的分化等,被广泛应用于DNA疫苗佐剂的研究中。本研究将猪圆环病毒Ⅱ型ORF2的B细胞表位基因(47-85aa)重组到猪细小病毒SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-OV。再通过基因柔性Linker将猪IFN-y基因定向克隆到该载体,构建重组质粒pCI-IOV。将阳性真核质粒转染Vero细胞,采用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测技术确定产物的表达情况；用MTT法检测产物的生物活性。结果显示,在转染重组质粒的哺乳动物细胞中既能扩增到目的基因,也能检测到特异性蛋白的表达,证实其表达蛋白具有显著的生物学活性。将重组质粒pCI-OV, pCI-IOV,对照质粒pCI-neo, PBS,猪细小病毒灭活苗,猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能,T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV, PCV2抗体水平。结果显示,重组质粒免疫小鼠后均能刺激机体产生良好的免疫应答,且pCI-IOV免疫小鼠脾淋巴细胞转化功能,CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和血清PPV/PCV2抗体的OD值在二免后均高于或显著高于细小灭活苗组、圆环亚单位苗组和pCI-OV对照组。结果表明,猪IFN-γ作为细胞因子佐剂能显著增强VP2/ORF2核酸疫苗诱导的免疫应答,整体效果高于普通疫苗组。研究结果为PPV和PCV2新型疫苗的研究提供了数据参考。于一免后24 h、7d、14 d、21 d、28 d、35 d、49 d、及105 d采集小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肌肉,提取各组织DNA进行PCR扩增。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到小鼠细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明,一免后24h、7d、14d、21d、28d、35d及49 d能在小鼠血液及各检测的组织器官检测到重组质粒；一免后105 d不能检测到重组质粒。纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合情况,证实该DNA疫苗安全性好。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
目录  7-9
第一章 文献综述  9-25
  1. 猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因及其编码蛋白的研究进展  9-14
    1.1 猪圆环病毒病原特征和基因组特点  9-10
    1.2 猪圆环病毒Ⅱ结构蛋白的抗原表位研究  10-12
    1.3 猪圆环病毒ORF2及其编码蛋白的功能研究  12-14
  2. 猪细小病毒的疫苗研究进展  14-22
    2.1 猪细小病毒病的发生与流行特点  14-15
    2.2 猪细小病毒疫苗研究的主要内容  15-22
  3. 猪IFN-γ的疫苗免疫佐剂的应用  22-24
  4. 本研究的目的和意义  24-25
第二章 实验研究  25-58
  1. 实验材料  25-26
    1.1 质粒、菌株及细胞  25
    1.2 主要试剂及药品  25
    1.3 主要仪器  25-26
  2. 方法  26-40
    2.1 PPV VP2基因的PCR、克隆及鉴定  26-28
    2.2 PCV2 ORF2基因的PCR、克隆及鉴定  28-29
    2.3 猪干扰素-γ基因的PCR、克隆及鉴定  29-31
    2.4 含PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因的重组质粒载体的构建  31-32
    2.5 真核表达载体pCI-OV的构建  32-33
    2.6 真核表达载体质粒(pCI-IOV)的构建  33-34
    2.7 pCI-OV和pCI-IOV质粒DNA转染Vero细胞  34-35
    2.8 重组质粒的表达及检测  35-36
    2.9 DNA疫苗对小鼠免疫效果的研究  36-40
  3. 结果与分析  40-48
    3.1 pMD-VP2的构建  40
    3.2 pMD-ORF2的构建  40-41
    3.3 猪干扰素-γ基因的构建  41-42
    3.4 pMD-ORF2.VP2的鉴定  42
    3.5 重组质粒pCI-OV的鉴定  42
    3.6 重组质粒pCI-IOV的鉴定  42-43
    3.7 pCI-OV和pCI-IOV的表达及检测  43-45
    3.8 DNA疫苗对小鼠免疫效果的研究  45-48
  4. 讨论  48-56
    4.1 安全性核酸疫苗的设计  48-51
    4.2 重组质粒的构建策略  51-52
    4.3 关于表达  52-53
    4.4 核酸疫苗对小鼠免疫效力的研究  53-56
  5. 结论  56-58
参考文献  58-63
致谢  63-64
攻读学位期间发表的学术论文  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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