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兔MT1，MT2和MT3基因CDS区克隆及MT2基因原核表达

作　者: 王昆
导　师: 赖松家
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 比利时兔 MT CDS区克隆生物信息分析原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本试验以健康无病的10只比利时兔为材料,分别从兔肌肉、大脑和肝组织中提取总RNA。根据GenBank中已发表的人、小鼠、牛、大鼠的MT1,MT2和MT3基因的CDS区序列设计引物,通过RT-PCR和克隆技术分别克隆出兔MT1,MT2和MT3基因的CDS全序列。MT1,MT2和MT3基因CDS区序列分别全长186bp、186bp和201bp,编码61、61和66个氨基酸。MT1,MT2和MT3基因之间的核苷酸同源性为82.42%,氨基酸同源性为78.28%。其中MT1和MT2基因核苷酸同源性为89.59%,氨基酸同源性为81.97%；MT2与MT3基因核苷酸同源性为76.27%,氨基酸同源性为63.64%；MT1与MT3基因核苷酸同源性为75%,氨基酸同源性为66.67%。通过核苷酸序列分析结果显示兔MT1基因与狗、人、大鼠和小鼠的同源性较高；兔MT2基因与人、大鼠、小鼠和猩猩的同源性较高；兔MT3基因与牛、狗、人、大鼠、野猪、小鼠和绵羊的同源性较高。对包括兔在内的不同哺乳动物MT1,MT2和MT3氨基酸序列构建NJ系统进化树。对兔MT1,MT2和MT3基因进行生物信息学分析,预测出其编码蛋白分子量分别约为6.8kDa、7.2 kDa和14.25kDa、等电点分别为5.12、5.34和5.32。兔MT1存在5个疏水区、3个潜在的磷酸化位点、存在10个可能二硫键以维持其立体结构。兔MT2存在5个疏水区、2个潜在磷酸化位点、存在10个可能二硫键以维持其立体结构。兔MT3存在1个潜在的N-糖基化位点199处、1个主要的疏水区、2个潜在的磷酸化位点、存在可能的10个二硫键以维持其立体结构；通过二级结构预测,发现兔MT1的二级结构由59个氨基酸残基组成的无规则卷曲形成,占96.72%；MT2的二级结构有58个氨基酸残基形成无规则卷曲和3个氨基酸残基形成延伸链,分别占95.08%和4.92%；MT3的二级结构是以1个a-螺旋为基础的,a螺旋由6个氨基酸残基形成,占9.09%；螺旋之间为无规则卷曲,‘由54个氨基酸残基形成,占81.82%。将兔MT2基因的编码序列构建到表达载体pET-32a上,pET-32a-MT2在大肠杆BL21(DE3)中进行原核表达,发现MT2蛋白与pET-32a上Trx,His和S标签序列形成大小为27kDa左右的融合蛋白,该结果并于预期的结果一致。对融合蛋白表达条件进行优化,发现最佳诱导浓度为0.6 mmol,最佳诱导时间为8h。通过对融合蛋白可溶性分析发现该蛋白具有包涵体形式和分泌蛋白形式。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
1 文献综述  10-17
  1.1 研究背景  10
  1.2 MT基因的研究现状  10-15
    1.2.1 MT的发现  10
    1.2.2 MT基因的定位与结构  10-11
    1.2.3 MT基因在不同组织中表达  11
    1.2.4 MT基因的调控机理  11-12
    1.2.5 MT的生物学功能  12-15
  1.3 本研究内容与目的意义  15-17
2 材料与方法  17-32
  2.1 试验材料  17-20
    2.1.1 试验动物组织样品  17
    2.1.2 试验仪器设备  17-18
    2.1.3 试验载体  18
    2.1.4 试验菌株  18
    2.1.5 试验主要试剂  18-19
    2.1.6 试剂溶液的配制  19-20
  2.2 兔MT1,MT2和MT3基因CDS区的克隆  20-25
    2.2.1 总RNA的提取  20-21
    2.2.2 总RNA的检测  21
    2.2.3 反转录反应cDNA第一条链合成  21
    2.2.4 PCR扩增  21-23
    2.2.5 PCR产物的克隆  23-25
  2.3 生物信息学分析  25-26
    2.3.1 蛋白质分子量与等电点预测  25
    2.3.2 蛋白质糖基化位点预测  25
    2.3.3 蛋白质疏水性预测  25
    2.3.4 蛋白质磷酸化位点预测  25
    2.3.5 蛋白质二硫键预测  25
    2.3.6 蛋白质信号肽预测  25
    2.3.7 蛋白质跨膜区预测  25
    2.3.8 密码子偏倚性预测  25-26
    2.3.9 蛋白质二级结构预测  26
  2.4 兔MT2基因原核表达  26-32
    2.4.1 MT2基因酶切引物设计  26
    2.4.2 PCR扩增  26-27
    2.4.3 PCR反应产物纯化与回收  27
    2.4.4 MT2基因与T载体的连接  27
    2.4.5 MT2基因转化与鉴定  27
    2.4.6 原核表达载体的构建  27-29
    2.4.7 重组蛋白的表达  29-30
    2.4.8 蛋白质可溶性分析  30
    2.4.9 SDS-PAGE电泳  30-32
3 结果与分析  32-52
  3.1 兔MT1,MT2和MT3基因CDS区克隆  32-34
    3.1.1 兔MT1,MT2和MT3基因RNA提取  32
    3.1.2 MT1,MT2和MT3基因cDNA的RCR扩增效果  32-33
    3.1.3 MT1,MT2和MT3基因菌液PCR鉴定  33-34
  3.2 MT2基因原核表达  34-37
    3.2.1 双酶切  34-35
    3.2.2 兔MT2基因原核表达  35-36
    3.2.3 兔MT2基因原核表达条件的优化  36-37
    3.2.4 兔MT2蛋白的可溶·性分析  37
  3.3 兔MT1,MT2和MT3基因CDS区序列分析  37-42
    3.3.1 兔MT1,MT2和MT3基因核苷酸和氨基酸组成分析  37-40
    3.3.2 兔MT1,MT2和MT3基因同源性分析  40-42
  3.4 兔MT1,MT2和MT2基因的生物信息学预测分析  42-52
    3.4.1 兔MT1,MT2和MT3基因编码蛋白分子量与等电点的预测  42
    3.4.2 兔MT1,MT2和MT3糖基化位点预测  42-44
    3.4.3 兔MT1,MT2和MT3疏水性预测  44-45
    3.4.4 兔MT1,MT2和MT3磷酸化位点预测  45-46
    3.4.5 兔MT1,MT2和MT3二硫键预测  46-47
    3.4.6 兔MT1,MT2和MT3信号肽预测  47-48
    3.4.7 兔MT1,MT2和MT3跨膜结构分析  48-49
    3.4.8 兔MT1,MT2和MT3基因CDS区密码子偏倚性分析  49-50
    3.4.9 兔MT1,MT2和MT3二级结构预测分析  50-52
4 讨论  52-56
  4.1 引物设计  52
    4.1.1 克隆引物设计  52
    4.1.2 酶切引物设计  52
  4.2 MT1,MT2和MT3基因序列讨论  52-53
  4.3 MT1,MT2和MT3系统进化树讨论  53
  4.4 MT1,MT2和MT3结构与功能讨论  53-54
  4.5 MT1,MT2和MT3基因CDS区偏倚性讨论  54
  4.6 MT2基因表达讨论  54-56
    4.6.1 原核表达载体讨论  54-55
    4.6.2 MT2基因表达蛋白讨论  55-56
5 结论  56-57
参考文献  57-62
致谢  62-63
附录  63

兔MT1，MT2和MT3基因CDS区克隆及MT2基因原核表达

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