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小鼠卵母细胞及早期胚胎的玻璃化冷冻

作　者: 杜文敬
导　师: 安铁洙
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 小鼠成熟卵母细胞早期胚胎玻璃化冷冻冷冻保护剂
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

为了筛选适合冷冻保存小鼠成熟卵母细胞的冷冻保护剂,并且初步探明小鼠成熟卵母细胞在冷冻过程中的损伤机制,本研究采集ICR雌性性成熟小鼠的成熟卵母细胞,采取细管法使用不同的冷冻保护剂(EFS40, VS1, A10-10)冷冻保存小鼠成熟卵母细胞,解冻后通过体外受精,体外培养及免疫荧光染色,检测冷冻-解冻后的小鼠成熟卵母细胞的受精与发育能力及活性与细胞骨架的变化。此外,为了探明适合小鼠不同时期胚胎的冷冻保护剂,本研究使用不同的冷冻保护剂(EFS40, EFS20-40, DAP213,GP25)采取细管法冷冻保存处于不同时期的小鼠早期胚胎(2细胞,4-8细胞及桑椹胚),解冻后将胚胎进行体外培养,观察其发育至扩张囊胚的能力。研究结果与结论如下：1.采用EFS、VS1及A10-10冷冻保存的小鼠成熟卵母细胞解冻后进行体外受精及体外培养,其结果,当用A10-10作为冷冻保护剂玻璃化冷冻小鼠成熟卵母细胞时,其回收后的形态正常率(68.0%)显著高于EFS和VS1(分别为16.7%和12.5%)(P<0.01),而且受精率(11.8%)也显著高于EFS和VS1(分别为0%和0%)(P<0.01)。表明,A10-10适用于冷冻保存小鼠成熟卵母细胞；2.将冷冻保存的小鼠成熟卵母细胞解冻,将其切割透明带后进行体外受精,发现切割的卵母细胞受精率(54.8%)显著高于未切割的卵母细胞受精卵(11.8%)。表明玻璃化冷冻-解冻过程可能改变透明带的结构,阻碍精子入卵而小鼠成熟卵母细胞体外受精率降低：如果在透明带上人为制作切口-则可促进精子入卵,以提高冷冻保存的小鼠成熟卵母细胞的体外受精率；3.采用免疫荧光染色检测小鼠成熟卵母细胞在冷冻前后的活性及细胞骨架的结果显示,不仅冷冻解冻过程对卵母细胞形态结构产生损伤作用,而且,高渗的冷冻保护剂处理同样改变卵母细胞的活性和细胞骨架；4.使用不同的冷冻保护剂(EFS40, EFS20-40, DAP213, GP25)采取细管法冷冻保存处于不同时期的小鼠早期胚胎(2细胞,4-8细胞及桑椹胚),解冻后将胚胎进行体外培养的结果显示,EFS20-40、EFS40、DAP213和GP25四种冷动保护剂中,与含有EG的EFS20-40和EFS40相比,含有GL和DMSO成分的GP253和DAP21对胚胎更具毒性；5.EFS20-40法适合用于小鼠的2细胞期和桑椹胚的冷冻保存,而EFS40法适合用于4-8细胞期胚胎的冷冻。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-16
  1.1 卵母细胞及胚胎冷冻保存的发展概况  9-10
    1.1.1 胚胎冷冻保存  9
    1.1.2 卵母细胞冷冻保存  9-10
  1.2 冷冻保护剂  10-11
    1.2.1 渗透性保护剂  10
    1.2.2 非渗透性保护剂  10-11
    1.2.3 混合保护剂  11
    1.2.4 抗冻蛋白  11
  1.3 冷冻保存对卵母细胞及胚胎的影响  11-12
    1.3.1 冷冻过程  11-12
    1.3.2 解冻过程  12
  1.4 常用的冷冻保存方法及其特点  12-14
    1.4.1 慢速冷冻和解冻  12-13
    1.4.2 快速冷冻慢速冷冻  13
    1.4.3 玻璃化冷冻  13-14
  1.5 卵母细胞及胚胎冷冻保存的应用  14-15
  1.6 本研究的目的与意义  15-16
2 小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻保存  16-25
  2.1 实验材料  16-18
    2.1.1 实验动物  16
    2.1.2. 实验试剂  16
    2.1.3 实验溶液配制  16-18
    2.1.4 实验仪器  18
  2.2 实验方法  18-21
    2.2.1 成熟卵母细胞采集  18
    2.2.2 成熟卵母细胞的冷冻与解冻  18
    2.2.3 小鼠成熟卵母细胞在冷冻保护剂中的毒性实验  18-19
    2.2.4 免疫荧光标记细胞骨架  19
    2.2.5 检测卵母细胞活力  19-20
    2.2.6 体外受精  20-21
    2.2.7 胚胎的体外培养  21
    2.2.8 数据统计  21
  2.3 实验结果  21-23
    2.3.1 冷冻保护剂对小鼠成熟卵母细胞的复苏及体外受精的影响  21
    2.3.2 冷冻保存(A10-10)对小鼠卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响  21-22
    2.3.3 透明带切割对冷冻-解冻小鼠成熟卵母细胞体外受精的影响  22
    2.3.4 检测玻璃化冷冻保存(A10-10)后卵母细胞的活力  22
    2.3.5 检测玻璃化冷冻保存(A10-10)后卵母细胞纺锤体及染色体形态  22-23
  2.4 讨论  23-24
  2.5 本章小结  24-25
3 小鼠早期胚胎的冷冻保存  25-31
  3.1 实验材料  25-26
    3.1.1 实验动物  25
    3.1.2 实验试剂  25
    3.1.3 实验溶液配制  25
    3.1.4 实验仪器  25-26
  3.2 实验方法  26-27
    3.2.1 胚胎的采集  26
    3.2.2 胚胎的冷冻及解冻  26
    3.2.3 小鼠早期胚胎在冷冻保护剂中的毒性实验  26-27
    3.2.4 胚胎的体外培养  27
    3.2.5 数据统计  27
  3.3 实验结果  27-29
    3.3.1 不同冷冻保护剂对小鼠2细胞期胚胎发育的影响  27
    3.3.2 超低温冷冻保存对小鼠2细胞期胚胎发育的影响  27-28
    3.3.3 不同冷冻保护剂对小鼠4-8细胞期胚胎发育的影响  28
    3.3.4 超低温冷冻保存对小鼠4-8细胞期胚胎发育的影响  28
    3.3.5 不同冷冻保护剂对小鼠桑椹期胚胎发育的影响  28-29
    3.3.6 超低温冷冻保存对小鼠桑椹期胚胎发育的影响  29
  3.4 讨论  29-30
  3.5 本章小结  30-31
结论  31-32
参考文献  32-35
攻读学位期间发表的学术论文  35-36
致谢  36-37

小鼠卵母细胞及早期胚胎的玻璃化冷冻

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