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CaWRKY5启动子分离及其在烟草瞬间表达系统中分析

作　者: 刘志钦
导　师: 何水林
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: LA-PCR技术启动子 Gateway技术农杆菌渗透法化学组织分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

WRKY是植物基因组中特有的一类转录因子大家族,研究表明植物WRKY家族的不同成员参与了植物生长、发育以及对逆境胁迫应答的调控并在其中起重要的作用。CaWRKY5是辣椒WRKY家族的一个成员,初步研究结果表明该基因的转录表达受高温、盐胁迫以及病原菌侵染等的影响,并在对这些逆境抗性反应中起重要的调节作用,但对其诱导表达的分子机制还不很清楚。为了进一步明确CaWRKY5受逆境胁迫诱导表达的分子基础,本研究从辣椒基因组DNA中分离获得了CaWRKY5的相应启动子,并利用农杆菌介导的烟草叶片瞬间表达系统,通过deletion缺失突变体分析进一步分析了该启动子对不同逆境的应答并分析了可能的顺式作用元件。主要研究如下:1)利用LA-PCR技术从辣椒基因组DNA克隆得到CaWRKY5基因5’端上游-936bp的启动子调控序列。用生物信息学对序列进行分析表明,该启动子TATA框为起始密码子ATG上游-140bp至-136bp的TATATAA,同时含有多种与逆境胁迫相关的顺式作用元件,如W-box,S-box,SA应答元件和类似ABRE元件等。2)CaWRKYK5基因-936bp启动子是一个完整的启动子区域,具有启动子表达活性。在青枯病病原菌侵染和MeJA诱导作用下,长于-886bp的启动子缺失体都可以激活GUS基因的表达,而-489bp的启动子序列却不足以激活GUS表达,说明启动子应答青枯病菌的核心元件分布在启动子-886bp至-489bp之间。-336bp以上的启动子区域在机械损伤和SA的诱导处理下均可激活GUS基因的表达,说明启动子应答机械损伤和SA的核心区域分布在启动子上游的-336bp的区域里。对启动子4个缺失体进行ET(ethylene treatment)处理应答分析,发现-936bp和-336bp区域的缺失体均可激活GUS基因表达,而其中的-886bp和-489bp区域的缺失体却不能激活GUS基因的表达,说明启动子应答乙烯的核心区域分布在-336bp至ATG以及-936bp至-886bp的区域,而-489bp至-336bp区域中可能含有对乙烯应答起着负调控的调控元件。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
1 前言  10-17
  1.1 开展应答逆境转录因子基因启动子分离及表达分子机制研究的意义  10
  1.2 WRKY 转录因子及启动子相关研究进展  10-16
    1.2.1 WRKY 转录因子的结构与功能  10-12
      1.2.1.1 WRKY 转录因子的结构和分类  10-11
      1.2.1.2 WRKY 转录因子在防御反应中的作用  11-12
      1.2.1.3 WRKY 转录因子在植物生长发育中的调节作用  12
      1.2.1.4 WRKY 转录因子在植物物质代谢中的调节作用  12
    1.2.2 植物基因启动子的结构与分类  12-16
      1.2.2.1 植物基因启动子的结构  12-14
        1.2.2.1.1 TATA 框  13
        1.2.2.1.2 CAAT-box  13-14
      1.2.2.2 植物基因启动子分类  14-16
        1.2.2.2.1 组成型启动子  14
        1.2.2.2.2 组织或器官特异性启动子  14-15
        1.2.2.2.3 诱导型启动子与顺式作用元件  15-16
    1.2.3 WRKY 蛋白的启动子结构与及其表达  16
  1.3 本课题研究的目的和意义  16-17
2 材料与方法  17-21
  2.1 材料  17
  2.2 实验方法  17-21
    2.2.1 CTAB 法提取辣椒基因组DNA  17-18
    2.2.2 LA-PCR 分离CaWRKY5 基因的启动子  18
    2.2.3 启动子缺失体的转化载体构建  18-19
    2.2.4 烟草无菌苗的准备  19
    2.2.5 农杆菌介导瞬间表达实验  19-20
    2.2.6 对烟草进行几种逆境处理  20
    2.2.7 GUS 化学组织分析  20-21
3 结果分析  21-27
  3.1 LA-PCR 获取CaWRKY5 基因的启动子序列  21-22
    3.1.1 LA-PCR 15t PCR  21
    3.1.2 LA-PCR 211d PCR  21-22
    3.1.3 TA 单克隆PCR 验证  22
  3.2 CaWRKY5 基因启动子的序列分析  22-23
  3.3 启动子缺失体的转化载体构建  23-25
    3.3.1 启动子各缺失体加内外侧引物PCR 反应的鉴定  24
    3.3.2 BP 反应重组质粒pDONR207-X 的PCR 鉴定  24-25
    3.3.3 Gateway LR 反应重组载体质粒pBGdGUS-X 的鉴定  25
    3.3.4 四个缺失体转化子的鉴定  25
  3.4 启动子各缺失体在烟草叶片瞬间表达系统中的表达分析  25-27
    3.4.1 全长启动子对几种诱导处理应答的分析  25-26
    3.4.2 启动子各缺失体几种逆境诱导下的GUS 组织化学分析  26-27
4 讨论与结论  27-30
  4.1 LA-PCR 和农杆菌渗入法的使用  27-28
  4.2 CaWRKY5 启动子的表达分析  28-30
参考文献  30-34
附录  34-39
  附录1 缩略词及英汉对照  34
  附录2 主要实验仪器和试剂盒  34-35
  附录3 培养基的配方  35-37
  附录4 本文中涉及的质粒  37-38
  附录5 LA-PCR 原理图  38
  附录6 DNA Marker 示意图  38-39
致谢  39

CaWRKY5启动子分离及其在烟草瞬间表达系统中分析

内容摘要

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