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中国卤虫Ste20激酶在不同发育时期及在高渗透压下的表达

作　者: 刘玉冬
导　师: 侯林
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 中国卤虫 Ste20激酶 半定量PCR 整体免疫组化 实时荧光定量PCR
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


中国卤虫隶属于节肢动物门(Phylum Arthropoda),壳纲(Crustacea),无甲目(Anostacea),卤虫属(Artemia)。主要分布于山西、新疆、西藏、青海、内蒙等内陆盐湖、盐井等高盐水体中,渗透调节功能对卤虫维持其在高渗透压下的生存起关键作用。中国卤虫因其自身发育时期的特点,渗透压调节的器官亦有所不同。无节幼体时期主要依靠盐腺来调节,到了成虫期则主要依靠附肢调节。在酵母中Ste20的信号通路已研究的较为彻底,但是在低等动物和哺乳动物还尚未清楚。因此本实验可以为Ste20激酶调节渗透压信号通路的研究提供参考价值。本研究采用生物信息学通过从美国卤虫EST文库的数据库中搜索出一条美国卤虫Ste20激酶家族的片段序列,通过在NCBI序列同源性比对,该片段与Ste20激酶家族有着较高的相似性。NCBI保守区域的分析,该段序列含有Ste20激酶家族保守的功能催化区。根据这段序列设计引物进行RT-PCR,得到了222bp片段经测序与美国卤虫文库中的Ste20激酶相似度达100%。采用半定量PCR对40h中国卤虫在不同渗透压条件下(盐度为2.8%,10%,15%,20%)Ste20激酶的表达情况进行了初步探究,发现Ste20激酶的表达量随盐度的增大而增大,说明Ste20激酶可能与渗透压的调节有关。采用整体免疫组化技术对中国卤虫不同发育时期的表达部位进行研究,结果发现0h,5h和10小时Ste20在虫卵内表达较为平均,15h和20h Ste20主要在卤虫无节幼体的头胸部表达,但20h在腹部已有少量表达,到40h表达的主要部位还是头胸部,腹部两侧少量表达,3d的Ste20表达部位集中头胸部、腹部表面及肠道,5d集中在头胸部、腹部表面及肠道以外,卤虫附肢也有部分表达,到了7d附肢和头胸部、腹部表面及肠道是主要的表达部位。最后采用实时荧光定量PCR对Ste20激酶在不同发育时期的表达量进行研究,结果发现Ste20激酶在中国卤虫不同发育时期的表达量不同,在20小时前后表达量最高,其余时期Ste20表达量较为均衡。推测Ste20激酶不仅具有调节渗透压的功能,而且还可能参与调节胚胎发育、细胞生长和分化等相关生理生化过程。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 前言  8-18
  1.1 卤虫的分类地位、生物学特征和分布的研究  8-10
    1.1.1 卤虫的分类学地位及形态学特征  8-9
    1.1.2 卤虫的生殖学特征  9
    1.1.3 卤虫的分类和分布  9-10
    1.1.4 卤虫的经济及生物学价值  10
  1.2 Ste20 家族相关基因研究工作  10-15
    1.2.1 Ste20 激酶调控 Na-K-2Cl 和K-Cl 共转运体机制的研究  11-13
    1.2.2 Ste20 调控ClC Cl 离子通道信号通路的研究  13-15
  1.3 卤虫渗透压应答相关基因的研究  15-17
    1.3.1 TRH 基因在卤虫渗透压调节过程中的作用  15-16
    1.3.2 APH 基因在卤虫渗透压调节过程中的作用  16-17
  1.4 本研究的目的和意义  17-18
第二章 中国卤虫Ste20 激酶在不同盐度下的表达  18-31
  2.1 实验材料与方法  18-24
    2.1.1 实验材料  18-19
    2.1.2 实验方法  19-24
  2.2 结果  24-28
    2.2.1 总RNA 的质量检测  24
    2.2.2 PCR 扩增结果  24-25
    2.2.3 PCR 扩增结果及序列分析  25-27
    2.2.4 β-actin 基因半定量PCR 结果  27
    2.2.5 Ste20 激酶半定量PCR 结果  27-28
  2.3 讨论  28-31
    2.3.1 Ste20 激酶在不同盐度下的表达量的变化  28-29
    2.3.2 实验条件优化  29-31
第三章 中国卤虫不同发育时期Ste20 激酶的表达部位  31-38
  3.1 实验材料与方法  31-34
    3.1.1 实验材料  31-32
    3.1.2 实验方法  32-34
  3.2 实验结果  34-37
  3.3 讨论  37-38
    3.3.1 中国卤虫不同发育时期Ste20 激酶表达部位的变化  37
    3.3.2 实验条件的优化  37-38
第四章 中国卤虫Ste20 激酶在不同发育时期的表达  38-48
  4.1 实验材料与方法  38-40
    4.1.1 实验材料  38
    4.1.2 实验方法  38-40
  4.2 结果  40-46
    4.2.1 标准曲线和线性关系  40
    4.2.2 扩增曲线和溶解曲线的分析  40-44
    4.2.3 计算相对表达量  44-46
  4.3 讨论  46-48
    4.3.1 中国卤虫Ste20 激酶在不同发育时期的表达变化  46-47
    4.3.2 实验条件的优化  47-48
参考文献  48-52
致谢  52

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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