学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
组织型纤溶酶原激活剂—膜联蛋白A5融合基因的构建
作 者: 沈友进
导 师: 尹俊
学 校: 汕头大学
专 业: 内科学
关键词: 组织型纤溶酶原激活剂 膜联蛋白A5 融合基因 靶向性 溶栓
分类号: R346
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 20次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
|
[研究背景]血栓性疾病是指继发于（或并发）血栓形成的疾病,形成的血栓常阻塞局部血流或脱落成栓子堵塞下游血流造成血栓栓塞从而引起组织缺血和坏死进而影响器官功能。据世界卫生组织统计,目前血栓性疾病的死亡率已跃居全球疾病总死亡率的首位,成为严重危害人类健康的疾病,因而防治血栓形成已经引起了医药学界的高度重视与普遍关注。溶栓治疗是治疗血栓性疾病的主要方法,通过应用溶栓药物激活纤溶酶原（plasminogen,PLG）,使之转变为纤溶酶（plasmin,PL）,进而溶解血栓中的纤维蛋白,最终使血栓溶解。组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator, tPA）是一种丝氨酸蛋白酶,为最主要的生理性纤溶酶原激活剂,可通过其赖氨酸残基选择性地与血栓表面的纤维蛋白结合,激活血栓中已与纤维蛋白结合的PLG,使之转变成PL,继而溶解纤维蛋白,使血栓溶解。目前,tPA已广泛应用于血栓性疾病的治疗。但由于tPA溶栓的特异性不强,相当一部分患者在应用tPA后仍表现为出血倾向。因此,寻找更为特异的溶栓药是必要而且迫切的。人膜联蛋白A5（annexin A5）是一种Ca2+依赖性、结合带负电荷磷脂表面的通道蛋白,分子量约34 kDa,主要存在于细胞膜和内质网膜上。它具有抗凝血活性,在Ca2+存在下,annexin A5和裸露在活化血小板膜表面的磷脂酰丝氨酸具有高度的亲和力,因而可以将annexin A5作为一种靶向剂,将溶栓药靶向到富含血小板的血栓。出于这一设想,本研究设计并构建了tPA-annexin A5融合基因,并为以后该融合基因在体外转染CHO细胞系,在CHO细胞中表达tPA-annexin A5融合蛋白打下基础。[目的]本研究的目的是提供一种具有抗凝及特异性溶栓活性的溶栓药组织型纤溶酶原激活剂-膜联蛋白A5融合蛋白基因的设计和制备方法。本研究的另一目的是为下一步获得初步纯化的融合蛋白,以此作为一种新型溶栓药应用于临床上血栓性疾病的治疗。[材料和方法]本研究的实施方案通过下述方法和步骤进行:1.tPA基因和annexin A5基因的获得从广州复能基因有限公司购买含有tPA cDNA的质粒pOTB7-tPA,转化大肠杆菌JM109,氯霉素筛选后挑阳性菌落,37℃过夜培养,送1ml菌液到大连Takara公司测序,将测序结果pOTB7-tPA中的tPA基因序列与NCBI Genebank中的BT007060（1689bp）比对。含有annexin A5基因的pcDNA3.1-annexin A5由高福禄教授馈赠,转化大肠杆菌JM109,氨苄青霉素和新霉素筛选后挑取阳性克隆,摇菌培养,送1ml菌液到大连Takara公司测序,将测序结果中annexin A5基因序列与NCBI Genebank中的NM000930序列比对。2.tPA cDNA的扩增以Primer Premier5.0软件依据人tPA的保守序列设计特异性引物,其正向引物5’端引入Hind III酶切位点,其反向引物5’端引入Kpn I酶切位点,反向引物与Kpn I酶切位点之间加上柔性寡肽基因序列。按设计合成引物,从含有tPA基因的质粒载体pOTB7-tPA中用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的方法扩增tPA cDNA,1%琼脂糖电泳鉴定。3.tPA cDNA的T-A克隆将扩增的t-PA cDNA按Invitrogen公司的pCR?2.1-TOPO载体说明书亚克隆入pCR?2.1-TOPO,构建pCR?2.1-TOPO/tPA,继之转化TOP10大肠杆菌,加50μg/ml氨苄青霉素和40mg/ml X-gal,蓝白斑筛选,挑阳性菌落（白斑）扩增培养,提取质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。4.pcDNA3.1-tPA-annexin A5的构建将质粒pCR?2.1-TOPO/tPA和质粒pcDNA3.1-annexin A5以HindⅢ及KpnⅠ双酶切后,1%琼脂糖电泳,电泳显示酶切后的tPA和开环pcDNA3.1-annexin A5;在紫外光下切琼脂糖凝胶回收目的DNA条带,以DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA,以此来提高目的DNA片段的纯度,琼脂糖电泳鉴定是否回收到足够多的目的DNA。以Quick T4 DNA连接酶连接切胶回收的上述两个DNA片段,转化JM109大肠杆菌,提取质粒,电泳初步鉴定是否获得目的质粒;重新双酶切后电泳鉴定是否符合tPA和pcDNA3.1-annexin A5的分子量。5.测序及序列比对将符合设计要求的连接转化后提取的质粒送Takara公司测序,在NCBI上的Blast软件和单机软件DNAMAN进行序列比对,看是否完全符合设计要求。[结果]1.测序结果示:pOTB7-tPA中的tPA基因序列与NCBI Genebank中的BT007060（1689bp）一致;质粒pcDNA3.1-annexin A5中annexin A5基因序列与NCBI Genebank中的NM000930序列比对一致。2.从含有tPA基因的质粒载体pOTB7-tPA中用PCR方法克隆出tPA基因的cDNA,1%琼脂糖电泳鉴定,其分子量与Genebank BT007060（1689bp）比对一致。3.tPA基因片段的T-A克隆后,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆成功。4.双酶切后,电泳显示酶切后的tPA与酶切后的开环pcDNA3.1-annexin A5;切琼脂糖凝胶回收DNA,琼脂糖电泳鉴定已回收到足够的目的DNA。在37℃进行连接反应,电泳初步鉴定获得融合基因;重新双酶切后电泳鉴定符合tPA和pcDNA3.1-annexin A5的分子量。5.融合基因测序后序列比对结果显示,质粒载体pcDNA3.1-tPA-annexin A5中融合基因tPA-annexin A5连接正确。[结论]1.设计出含tPA-annexin A5融合基因的质粒载体pcDNA3.1-tPA-annexin A5。2.成功地构建了含tPA-annexin A5融合基因的质粒载体pcDNA3.1-tPA-annexin A5。
|
全文目录
中文摘要 6-9
英文摘要 9-13
缩略语表 13-14
第1章 前言 14-18
第2章 实验材料 18-21
1 试剂与药品 18-19
2 仪器与设备 19-20
3 质粒及细胞的获取 20-21
第3章 实验方法 21-30
1 融合基因的设计 21-23
2 从 pOTB7-tPA 基因中 PCR 扩增 tPA 基因 23-24
3 tPA 基因片段的T-A 克隆 24-26
4 质粒pCR?2.1-TOPO/tPA 和质粒pcDNA3.1-annexin A5 双酶切后连接 26-29
5 pcDNA3.1-tPA-annexin A5 测序及序列比对 29-30
第4章 实验结果 30-36
第5章 讨论 36-42
第6章 结论 42-43
第7章 展望 43-46
参考文献 46-52
附录1 主要试剂配制 52-54
附录2 附图 54-60
文献综述 60-68
参考文献 65-68
致谢 68-69
发表论文情况 69-70
个人简历 70
|
相似论文
- 蜂毒肽基因的原核重组表达及其在Hela细胞中的靶向转录研究,R346
- 灌注CT原始图像鉴别梗死中心与缺血半暗带,R743.3
- 特力普酶溶栓治疗急性心肌梗死的临床观察,R542.22
- 慢性粒细胞白血病病人Mcl-1基因和bcr/abl基因的表达及临床意义,R733.72
- CD59-CD2融合蛋白真核表达载体的构建及对T细胞信号转导的作用研究,R392.1
- 下调MSI2基因对k562细胞BCR-ABL融合基因表达的影响,R55
- Annexin A5表达与鼻咽癌关系研究,R739.6
- 氨基甾体小分子L1对K562慢粒白血病细胞系的作用和机制,R733.7
- 罕见的急性粒细胞巨核细胞白血病的生物学、临床和血液特征,R733.7
- 肺癌特异性结合多肽ZS-1的靶向性鉴定和药动学研究,R734.2
- 导管溶栓治疗早期髂股静脉血栓形成的疗效及安全性系统评价,R654.4
- “右旋糖酐—磁性LDH-Fu”转运模型磁靶向缓控释作用的大鼠实验研究,R96
- 下肢深静脉血栓形成及其并发症在法医学鉴定的研究,D919.1
- 双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3原核表达质粒的构建及蛋白的诱导表达,R737.9
- 肠溶止痛栓在肛肠病术后镇痛的临床研究,R269
- 溶栓酶产生菌的分离筛选鉴定及发酵、提纯研究,R378
- 尼莫地平自乳化软胶囊的研究,R94
- PtCBF转化枳和椪柑及在枳和椪柑内的时空表达,S666
- 2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉大鼠组织分布的研究,R96
- 婴儿双歧杆菌对鼻咽癌组织乏氧区的靶向性研究,R739.63
- 食管鳞癌中融合基因的研究,R735.1
中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com
|