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病毒启动子调控下t-PA的稳定表达及半定量检测技术研究

作　者: 张守峰
导　师: 扈荣良
学　校: 中国人民解放军军需大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 组织型纤溶酶原激活剂 表达与调控 巨细胞病毒启动子 纤维蛋白平板溶圈法 检测
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 55次
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内容摘要


以不含5’-UTR的t-PA cDNA为目的基因，将其克隆在巨细胞病毒（CMV）启动子/增强子下游，构建了该病毒启动子/增强子指导下并含有筛选标记Neor的真核表达载体pCPA。应用脂质体介导法将pCPA和pSV2-dhfr二质粒共转染CHO-dhfr-细胞，在G418和选择培养基D-MEM的双重筛选下，获得了A10、B12、C9和H12 4个阳性表达细胞克隆，ELISA结果表明，其t-PA表达量为0.6～2.1μg/106cells.day。 参照GenBank相关序列，设计并合成了一对引物，以山羊基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出β-casein 5’-UTR全序列（111bp），克隆入pGEM-T载体后测序，结果与已知序列完全一致。以此UTR为调控元件之一，插入在t-PA cDNA之前，构建了真核表达载体pC5’PA。将pCPA和pC5’PA以磷酸钙共沉淀法分别转染COS-7细胞进行短暂表达，结果表明，转染二质粒后，t-PA在COS-7细胞中均能有效表达，但山羊β-casein 5’-UTR序列的插入，使t-PA的短暂表达量下降了约2/3。 在原有的t-PA纤溶活性检测法——纤维蛋白平板溶圈法（FAPA）基础上引入纤溶酶原作为附加组分，使FAPA的灵敏度提高了30倍。对不同纤溶酶原样品的对比研究表明，某些纤溶酶含量偏高的纤溶酶原制剂不宜作为附加组分使用。本研究还对影响溶圈形成的主要因素，如反应时间、纤维蛋白浓度、平板厚度等进行了标准化。

全文目录


中文摘要  4-5
前言  5-8
第一部分 t-PA稳定表达细胞株的建立  8-19
第二部分 山羊β-casein 5’-UTR的克隆及其对t-PA短暂表达量的影响  19-29
第三部分 t-PA体外纤溶活性及半定量检测方法的确立  29-34
参考文献  34-38
结论  38-39
致谢  39-40
英文摘要  40-41

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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