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细粒棘球绦虫pET30a-EgA31-Eg95重组质粒构建及鉴定

作　者: 贾海英
导　师: 丁剑冰
学　校: 新疆医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 细粒棘球绦虫 EgA31-Eg95抗原基因原核表达质粒
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:克隆细粒棘球绦虫Eg95、EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31及pET30a- EgA31-Eg95原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31及EgA31-Eg95重组蛋白,对表达产物进行免疫印迹分析。方法:从细粒棘球绦虫原头蚴及成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,分别以原头蚴cDNA及成虫cDNA为模板RT-PCR克隆获得Eg95和EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E.coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆,转化BL2(1DE3),IPTG初步诱导表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,凝胶图像分析系统确定目的蛋白表达水平。以测序正确的pET30a-EgA31重组质粒为载体,运用酶切连接技术构建pET30a-EgA31 -Eg95重组质粒,表达pET30a-EgA31-Eg95重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果:测序表明选取的pET30a-EgA31及pET30a-EgA31-Eg95阳性克隆均为正确连接目的基因的重组质粒。经IPTG诱导后重组蛋白均得到成功表达,分别在相对分子量约为31 kDa及46 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%及20%。结论:成功克隆并构建了pET30a-EgA31及pET30a-EgA31-Eg95原核表达质粒,初步诱导表达出EgA31、EgA31-Eg95及Eg95重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
前言  9-11
材料与方法  11-25
  1. 材料  11-14
    1.1 细粒棘球绦虫原头蚴和成虫标本及血清  11
    1.2 质粒及菌种  11
    1.3 主要试剂及配方  11-13
    1.4 主要仪器  13-14
    1.5 引物设计与合成  14
  2. 方法  14-25
    2.1 细粒棘球绦虫原头蚴及成虫总RNA 的提取及第一链cDNA 合成  14-15
    2.2 EgA31、Eg95 编码基因的克隆及鉴定  15-16
    2.3 重组质粒pUCm-T/EgA31、pUCm-T/Eg95 的构建及鉴定  16-18
    2.4 原核表达质粒pET30a-EgA31 的构建  18-20
    2.5 原核表达质粒pET30a-EgA31-Eg95 的构建  20-22
    2.6 重组蛋白的诱导表达  22-24
    2.7 重组蛋白的 Western blot 反应  24-25
结果  25-35
讨论  35-40
小结  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-46
附录  46-50
综述  50-60
攻读硕士学位期间发表的学术论文  60-61
导师评阅表  61

细粒棘球绦虫pET30a-EgA31-Eg95重组质粒构建及鉴定

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