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细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗保护力及其免疫机制研究

作　者: 叶艳菊
导　师: 李文桂
学　校: 重庆医科大学
专　业: 内科学
关键词: 细粒棘球绦虫疫苗转基因植物首蓿免疫机制
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的在构建细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗的基础上,提取转基因苜蓿叶蛋白,将叶蛋白提取液采用口服灌胃和鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠,动态观察其诱导的免疫应答的变化；将叶蛋白提取液采用口服灌胃和鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠后,再用Eg原头节攻击,研究该疫苗产生的保护力及其免疫机制。方法采用热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水配成20μg/μl。同时提取转空质粒(pBT121)苜蓿叶蛋白和正常苜蓿叶蛋白作对照。为了动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后诱导的免疫应答的变化,将88只雌性BALB/c小鼠随机分为2组,每组44只。口服灌胃组：每只小鼠灌胃100μl(约含1μg融合抗原)的转基因苜蓿叶蛋白提取液,灌胃前30 min先灌服5%的碳酸氢钠60μl,以中和胃酸；滴鼻接种组：每鼠接种10μl(约含0.1μg融合抗原)的转基因苜蓿叶蛋白提取液。以上各组每3d免疫1次,连续2个月。ELISA方法检测各组鼠免疫后不同时间(免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 w)血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平以及脾细胞体外培养原液及在受到EgAg或ConA(LPS)刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平；用MTT比色法检测脾细胞增殖水平；用FCM检测各组鼠免疫后不同时间(免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 w)脾细胞CD4+和CD8+亚群。为了研究细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后抗原头节攻击产生的保护力及其免疫机制,将32只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组8只。A组小鼠口服灌胃100μl的转基因苜蓿叶蛋白提取液(约含1μgEg95-EgA31融合抗原),接种前30min用5%碳酸氢钠60μl对小鼠进行灌胃,以中和胃酸；B组小鼠滴鼻接种10μl上述提取液(约含0.1μg Eg95-EgA31融合抗原)；C组小鼠滴鼻接种10μl的转空质粒苜蓿叶蛋白提取液(不含Eg95-EgA31融合抗原)；D组小鼠灌胃100μl的正常苜蓿叶蛋白提取液,接种前30 min用5%碳酸氢钠60μl对小鼠进行灌胃,以中和胃酸。以上各组每3d免疫1次,连续2个月。4组均于末次免疫后第8w用Eg原头节攻击。在Eg原头节攻击感染后第24 w剖杀各组小鼠,分离并称重细粒棘球蚴囊,计算囊重减少率；用ELISA方法检测各组鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平；双抗体夹心ELISA试剂盒检测各组鼠脾细胞体外培养原液及在受到EgAg或ConA(LPS)刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平；用MTT比色法检测脾细胞增殖水平；用FCM检测脾细胞CD4+和CD8+亚群；用Annexin V-FITC试剂盒检测脾细胞原液或用ConA刺激培养时细胞凋亡发生率。结果动态观察发现口服组小鼠的血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在末次免疫后2～14周、2～14周、4～20周、6～12周、6～12周和4～16周升高,分别在末次免疫后4、4、6、8、8和10周达最高水平；脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4-10周升高,在末次免疫后6周达最高水平；脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在免疫后6～10周和4～12周升高,分别在免疫后6周和8周达高峰；脾细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4～6周、2～8周、2～6周和4～12周升高,分别在免疫后4、2、2和8周达最高水平。鼻腔接种组小鼠的血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在末次免疫后2～14周、2～18周、4～10周、6～14周、8周和6～12周升高,分别在末次免疫后4、4、6、12、8和6周达最高水平；脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4-12周升高,在末次免疫后6周达最高水平；脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在末次免疫后4-6周和4-10周升高,分别在末次免疫后6周和8周达高峰；脾细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在末次免疫后4～6周、2～10周、4～10周和6～16周升高,分别在末次免疫后6、4、6和6周达最高水平。疫苗免疫及原头节攻击后发现与D组相比,A组小鼠检获棘球蚴包囊质量降低,囊重减少率为64.10%,脾T淋巴细胞增殖水平升高,CD4+、CD8+亚群和CD4+/CD8+比值均升高,血清IgG、IgG2b和IgE水平升高,脾细胞上清液中的IFN-γ、IL-12和TNF-α水平升高,IL-10水平降低,脾细胞凋亡率降低。B组与D组相比,囊重减少率无显著差异,脾T淋巴细胞增殖水平升高,CD4+亚群和CD4+/CD8+比值升高,血清IgG、IgG2b和IgE水平升高,脾细胞上清液中IFN-γ和TNF-α水平升高,脾细胞凋亡率降低。A组血清IgG水平、脾细胞上清液中IFN-γ和IL-12水平、CD4+亚群百分比及脾T淋巴细胞增殖水平均显著高于B组,脾细胞凋亡率显著低于B组,但2组囊重减少率相比无显著差异。C组与D组相比结果无显著差异。结论1.动态观察表明细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液口服和滴鼻接种均可诱导免疫鼠产生有效的免疫应答。2.保护力实验提示细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液口服接种能诱导免疫鼠产生一定的保护力,Th1型免疫应答在其诱导的保护性免疫机制中起重要作用。

全文目录

符号说明  7-10
中文摘要  10-14
英文摘要  14-20
前言  20-28
  参考文献  25-28
第一章细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后免疫反应的动态观察  28-60
  第一节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后IgG及其亚类和IgE的动态观察  28-38
    1 材料  28-29
    2 方法  29-31
    3 结果  31-35
    4 讨论  35-37
    参考文献  37-38
  第二节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后T淋巴细胞增殖的动态观察  38-44
    1 材料  38-39
    2 方法  39-40
    3 结果  40-42
    4 讨论  42-43
    参考文献  43-44
  第三节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后T淋巴细胞亚群的动态观察  44-49
    1 材料  44-45
    2 方法  45
    3 结果  45-47
    4 讨论  47-48
    参考文献  48-49
  第四节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后细胞因子的动态观察  49-60
    1 材料  49-50
    2 方法  50-51
    3 结果  51-58
    4 讨论  58-59
    参考文献  59-60
第二章细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护力及其免疫机制研究  60-89
  第一节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护力观察  60-66
    1 材料  61
    2 方法  61-63
    3 结果  63-64
    4 讨论  64-65
    参考文献  65-66
  第二节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c鼠T淋巴细胞增殖的研究  66-71
    1 材料  67
    2 方法  67-68
    3 结果  68-69
    4 讨论  69-70
    参考文献  70-71
  第三节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c鼠T淋巴细胞亚群变化的研究  71-75
    1 材料  71
    2 方法  71-72
    3 结果  72-73
    4 讨论  73-75
    参考文献  75
  第四节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c鼠细胞因子变化的研究  75-84
    1 材料  76
    2 方法  76-77
    3 结果  77-82
    4 讨论  82-83
    参考文献  83-84
  第五节细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗对BALB/c鼠脾细胞凋亡的影响  84-89
    1 材料  84
    2 方法  84-85
    3 结果  85-86
    4 讨论  86-87
    参考文献  87-89
全文总结  89-91
文献综述(一)  91-98
文献综述(二)  98-108
致谢  108-109
攻读学位期间发表的学术论文目录  109-110

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