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细粒棘球绦虫基因工程疫苗候选分子EgA31的原核表达及免疫学鉴定

作　者: 张立民
导　师: 傅玉才
学　校: 汕头大学
专　业: 免疫学
关键词: 细粒棘球绦虫融合蛋白疫苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

背景与目的包虫病是由细粒棘球绦虫的幼虫引起的一种人畜共患病，在我国牧区广泛流行，严重影响了牧区人民的健康并造成畜牧业的经济损失。目前对该病的控制主要以犬的驱虫和对牧民的预防教育为主，但在发展中国家效果较差。疫苗预防将是控制该病的理想途径。理论上，通过对中间宿主(羊、牛等家畜)或终末宿主采取有效的免疫保护均能切断细粒棘球绦虫生活史的循环链，阻断包虫病的流行。用于中间宿主(羊)的疫苗研究方面已取得较理想的结果。Lightowlers等报道了抗囊性包虫病的重组疫苗EG95，对羊的免疫保护率可达到96—100％，但由于牧区羊的数量巨大，牲畜疫苗免疫的实施费用较高，操作繁劳，难以被社会接受。犬是细粒棘球绦虫的终末宿主，控制了犬的感染就中断了虫卵的传播，从而保护中间宿主(包括人)免受感染，且牧区犬的数量远少于牛、羊等家畜，因此对终末宿主犬的免疫保护应是非常有效的途径。Fu等用感染犬血清在一细粒棘球绦虫cDNA表达文库中筛选出一66kDa cDNA克隆EgA31，该cDNA克隆5′端表达多肽可引起显著的宿主体液免疫和细胞免疫。为了获得更好的抗原性及免疫原性，本研究通过原核表达系统获得EgA31 cDNA 3′端表达多肽，对其抗原性和免疫原性进行分析、鉴定，为进一步将EgA31用于诊断及疫苗的研究奠定基础。材料和方法 (1) 通过PCR方法扩增EgA31cDNA，将得到的翔狩班/班笼生华业了跷之cDNA片断用限制性内切酶酶切，然后亚克隆入pGEx一SX一3表达质粒，鉴定、筛选阳性质粒，DNA测序仪测序。 (2)将阳性重组质粒转化君seh。:s。hia。011 BLZI宿主菌，IPTG诱导重组质粒的表达，优化表达条件。大量表达融合蛋白，GSTrapFF柱亲和层析纯化表达产物，SDS一PAGE鉴定表达产物的分子量及纯化效果，Bradford法测定重组蛋白含量。 (3)用纯化的融合蛋白免疫豚鼠，获得抗血清，ELISA法检测豚鼠抗体水平，Western blot法进行分析鉴定。研究结果(1) PCR扩增得到50ObpcDNA片断，亚克隆入pGEX载体，经酶切和PCR方法鉴定结果表明pGEx/EgA31重组质粒成功构建。测序检验重组质粒中EgA3 IcDNA序列无误。开放读码框正确。 (2)SDS一PAGE结果显示分离纯化的EgA31/GsT融合蛋白分子量大小约为45kDa，GSTrapFF柱亲和层析纯化表达产物得到较高纯度的融合蛋白，蛋白表达量可达到每升培养基15mg重组蛋白。(3)ELIsA结果显示EgA31/GST融合蛋白可激起豚鼠体内较强的体液免疫反应，IgG水平明显增高。免疫豚鼠得到的抗血清可与细粒棘球绦虫原头蝴总蛋白在66kDa处特异性反应。并与其它虫体蛋白之间存在交叉反应。结论(1)成功构建pGEX/EgA31重组质粒。(2)EgA31/GST融合蛋白获得高效表达，并成功纯化，具备被进一步制备为工程菌的条件。(3)融合蛋白可激起豚鼠较强的体液免疫反应，并与其它虫体蛋白之间存在交叉反应，为进一步将EgA31用于疫苗的研究奠定基础，并为将其用于其它虫体疫苗提供可能。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-9
前言  9-11
材料与方法  11-23
实验结果  23-31
讨论  31-38
结论  38-39
参考文献  39-44
附录1 试剂配制  44-47
附录2 英文缩略词表  47-48
致谢  48-49
文献综述  49-64

细粒棘球绦虫基因工程疫苗候选分子EgA31的原核表达及免疫学鉴定

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