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ALV-J分离株Hrb-1 gp85基因蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位初步分析

作　者: 侯磊
导　师: 张淼涛
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: J亚群禽白血病病毒 gp85基因单克隆抗体杆状病毒抗原表位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

J亚群禽白血病(Subgroup J Avian Leukosis)是由反转录病毒科J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus of Subgroup J,ALV-J)引起的一种主要侵害肉鸡的一种肿瘤性疾病。此病毒为ALV和禽内源性反转录病毒囊膜的重组体,因此,ALV-J可通过水平传播和垂直传播。目前,ALV-J已在世界范围内流行,给养禽业带来了巨大的经济损失,随后可引起感染鸡群产生肿瘤,造成死亡。但这种情况造成的死亡率不高。更值得我们重视的是ALV-J感染所引起的免疫抑制:鸡群的生产能力下降,免疫应答能力降低,容易继发感染其它微生物,从而造成多重感染。因此,由于gp85基因是ALV-J的主要抗原基因,确定ALV-J的gp85基因及其相应抗原的结构特点,将有助于进一步了解这一蛋白质的相关生物学特性,有助于人们了解反转录病毒尤其是那些无致癌基因病毒的致癌机制,从而为人类控制和预防癌症提供借鉴。本研究利用PCR的方法扩增出J亚群禽白血病病毒(ALV-J)分离株Hrb-1的囊膜蛋白基因中的gp85基因,构建了原核表达质粒pProEX HTb/gp85,转化入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出重组蛋白,将其与等量的佐剂乳化后免疫小鼠,制备多克隆抗体。同时,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建了pFast Bac HTA/gp85重组质粒,后转化入DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,获得杆状病毒重组载体Bacmid/ gp85,进而转染到Sf9细胞中,重组的gp85基因在其中获得表达,为表达gp85蛋白和后期的单克隆抗体的筛选奠定抗原方面的基础。以其相应基因构建的重组杆状病毒表达的gp85蛋白来作为检测抗原,经融合和ELISA筛选,同时在筛选过程中也运用细胞ELISA发进行配合鉴定,获得数株分泌gp85单克隆抗体的杂交瘤细胞,并用Western Blot检测方法对其单克隆抗体针对的抗原表位进行了初步分析。本研究通过抗原表位的筛选,初步确定两株单抗所针对的抗原区域,从而为今后明确相应的抗原结构,了解该抗原的生物学特性和设计相应的诊断试剂、疫苗提供科学依据。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-24
  1.1 禽白血病的研究概况  10-16
    1.1.1 病原学  10-11
    1.1.2 ALV- J 的病毒核酸、结构和编码蛋白  11-13
    1.1.3 ALV- J 病毒的基因组  13
    1.1.4 ALV- J 的病毒病原性及致病机理  13-14
    1.1.5 ALV- J 的流行病学、临诊症状及病理变化  14-15
    1.1.6 诊断及检测方法  15-16
    1.1.7 防制  16
  1.2 单克隆抗体的研究进展  16-18
  1.3 抗原表位的研究方法及研究进展  18-24
    1.3.1 抗原表位的预测  18-19
    1.3.2 抗原表位的测定  19-20
    1.3.3 抗原表位的应用研究和进展  20-21
    1.3.4 表位疫苗在疾病控制中的应用  21-24
第二章 ALV-J 分离株Hrb-1 gp85 基因蛋白的原核表达及多克隆血清的制备  24-34
  2.1 材料与方法  24-28
    2.1.1 病毒、血清、细胞、质粒及菌株  24
    2.1.2 引物  24-25
    2.1.3 主要试剂及仪器  25
    2.1.4 ALV-J Hrb-1 毒株的病毒培养  25
    2.1.5 病毒RNA 提取及gp85 基因的扩增  25
    2.1.6 gp85 蛋白特性的分析  25
    2.1.7 Hrb-1 株gp85 基因原核表达载体pProEX HTb/ gp85 的构建及鉴定  25-26
    2.1.8 重组蛋白的诱导表达、鉴定、纯化及复性  26-28
    2.1.9 鼠抗gp85 重组蛋白多克隆血清的制备  28
  2.2 结果与分析  28-32
    2.2.1 目的基因片段的扩增  28-29
    2.2.2 重组蛋白性质分析  29
    2.2.3 重组质粒的鉴定  29-30
    2.2.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定  30-31
    2.2.5 多克隆血清的效价测定和免疫原性分析  31-32
  2.3 讨论  32-33
  2.4 小结  33-34
第三章 ALV-J 分离株Hrb-1 gp85 基因杆状病毒表达载体的构建及重组蛋白的表达  34-43
  3.1 材料和方法  34-39
    3.1.1 病毒与细胞  34-35
    3.1.2 质粒、菌株、细胞与培养基  35
    3.1.3 试剂  35
    3.1.4 细菌培养基  35
    3.1.5 引物  35
    3.1.6 表达gp85 基因蛋白的重组杆状病毒的构建  35-38
    3.1.7 间接ELISA 检测rBac- gp85 在昆虫细胞中的表达  38
    3.1.8 间接IFA 检测rBac- gp85 在昆虫细胞中的表达  38-39
  3.2 结果与分析  39-41
    3.2.1 重组质粒p Fast BacHTA/ gp85 的构建及鉴定  39
    3.2.2 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid- gp85 的提取和鉴定  39-40
    3.2.3 重组杆状病毒rBac- gp85 的PCR 鉴定  40
    3.2.4 间接ELISA 检测gp85 表达  40-41
    3.2.5 间接IFA 检测gp85 表达  41
  3.3 讨论  41-42
  3.4 小结  42-43
第四章 ALV-J 分离株Hrb-1 gp85 基因蛋白单克隆抗体的制备  43-54
  4.1 材料和方法  43-49
    4.1.1 免疫抗原、细胞系及其培养基  43
    4.1.2 实验动物  43
    4.1.3 主要试剂及耗材  43-44
    4.1.4 动物免疫  44
    4.1.5 单克隆抗体的制备  44-48
    4.1.6 单克隆抗体腹水的制备  48
    4.1.7 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定  48-49
  4.2 结果  49-52
    4.2.1 单克隆抗体的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立  49-50
    4.2.2 单克隆抗体腹水效价的测定  50
    4.2.3 杂交瘤细胞的染色体分析  50-51
    4.2.4 杂交瘤细胞稳定性分析  51
    4.2.5 Western Blot 检测抗单克隆抗体特异性  51
    4.2.6 间接IFA 试验鉴定结果  51-52
  4.3 讨论  52-53
  4.4 小结  53-54
第五章 ALV-J 分离株Hrb-1 gp85 蛋白抗原表位的初步分析  54-61
  5.1 材料和方法  54-56
    5.1.1 质粒及菌株  54-55
    5.1.2 单克隆抗体  55
    5.1.3 试剂  55
    5.1.4 gp85 抗原表位的预测及分段引物的设计  55-56
    5.1.5 gp85 分段扩增、克隆与表达  56
    5.1.6 Western Blot 筛选抗原表位  56
  5.2 结果  56-59
    5.2.1 gp85 抗原表位的预测及分段引物的设计  56-57
    5.2.2 gp85 基因的分段表达  57-58
    5.2.3 Western Blot 筛选抗原表位  58-59
  5.3 讨论  59-60
  5.4 小结  60-61
结论  61-62
参考文献  62-69
致谢  69-70
作者简介  70

ALV-J分离株Hrb-1 gp85基因蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位初步分析

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