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肥大细胞靶向毒素的抗原性弱化重组构建研究

作　者: 刘昌文
导　师: 陶爱林
学　校: 广州医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重组免疫毒素抗原表位位点突变蛋白纯化
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:癌组织周围肥大细胞的存在以及肥大细胞产生的各种因子是癌组织周围血管大量生成、并进一步促进癌组织生长的一个重要原因,去除这些肥大细胞可能是治疗肿瘤的一个重要途径。本研究在实验室已经构建好的Ig-Fc-PEA免疫毒素的基础上,为了降低免疫毒素的毒副作用,对该靶向毒素MHC-Ⅰ类的抗原性进行综合分析,确定抗原改造的关键位点。通过定点突变技术改变其氨基酸序列,以降低其过敏原性。然后将改造后的免疫毒素基因序列导入载体,并转化入大肠杆菌中进行诱导表达目的蛋白,进行免疫学鉴定后采用镍柱亲和纯化法纯化出目的蛋白,然后通过透析进行蛋白复性,并且去除蛋白中的离子成份得到最终纯化的目的蛋白,为下一步目标蛋白功能试验打下坚实的基础。目的:在已构建的Ig-Fc-PEA免疫毒素的基础上,分析该免疫毒素的MHC-Ⅰ类抗原性表位,并对其抗原性进行有目的的改造,得到抗原性弱化的免疫毒素,以增强临床治疗效果和减少免疫相关的副反应。方法:1.使用MHC-Ⅰ抗原性表位软件SYFPEITH分析PEA氨基酸序列的抗原性表位,确定需要改造的位点;2.对需要改造的位点使用极性小、侧支少以及无芳香环的氨基酸取代该位点上极性大、侧支多以及有芳香环的氨基酸,得到抗原性低的序列;3.使用定点突变的方法对需要改造的位点进行定点突变,并进行重组表达和纯化;4.对各毒素蛋白进行免疫学鉴定。结果:1.获得了绿脓杆菌外毒素A(PEA)上二个重要的MHC-Ⅰ抗原表位位点;2.在此两个抗原表位的基础上,构建了六个重要的重组目的蛋白。结论:对IgE-Fc-PEA嵌合免疫毒素抗原性进行了分析,得到了两个重要的MHC-Ⅰ抗原表位位点,并针对这两个位点进行定点突变,得到六个突变蛋白株,为下一步免疫毒素的功能检测和验证打下了坚实的基础。

全文目录

缩略词表及中英文对照  4-5
中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-13
  1. 研究背景  9
  2. 国内外研究进展  9-11
  3. 研究方案  11-12
  4. 技术路线  12-13
材料与方法  13-26
  1. 仪器、材料与试剂  13-18
    1.1 主要仪器  13-14
    1.2 实验材料  14-15
    1.3 主要试剂  15-16
    1.4 其它主要试剂的配方  16-18
  2. 实验方法  18-26
    2.1 绿脓杆菌外毒素A（PEA）MHC-I 类抗原表位的确定  18
    2.2 MHC-I 类抗原性降低的突变株的构建和表达  18-23
    2.3 突变重组免疫毒素纯化  23-24
    2.4 免疫印迹检测重组突变蛋白表达  24-26
结果  26-38
  3.1 绿脓杆菌外毒素A（PEA）抗原性表位的筛选与改造  26-27
  3.2 重组免疫毒素突变蛋白216VL 菌株的构建、表达  27-28
  3.3 重组免疫毒素突变蛋白140I 菌株的构建、表达  28-30
  3.4 重组免疫毒素突变蛋白140LV 菌株的构建、表达  30-32
  3.5 重组免疫毒素突变蛋白140LVI 菌株的构建、表达  32-33
  3.6 重组免疫毒素突变蛋白TTH 菌株的构建、表达  33-35
  3.7 重组免疫毒素突变蛋白TLH 菌株的构建、表达  35-36
  3.8 重组免疫毒素蛋白的纯化  36-37
  3.9 重组免疫毒素突变蛋白菌株的免疫学鉴定  37
  3.10 各免疫毒素的透析、冻干、称重与保存  37-38
讨论  38-40
结论  40-41
附图  41-53
综述  53-58
参考文献  58-62
致谢  62-63
在攻读硕士学位期间论文发表情况  63-64

肥大细胞靶向毒素的抗原性弱化重组构建研究

内容摘要

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