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MULT1和MULT1S转基因小鼠的鉴定和初步分析及γδT细胞对类脂A识别机制的研究

作　者: 康垒
导　师: 何维；崔莲仙；马驰
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: MULT1 NKG2D配体转基因小鼠类脂A 树突状细胞 γδT细胞
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

NKG2D是一种激活性受体,由同源二聚体构成,可表达于NK细胞、NKT细胞、CD8+αβT细胞和γδT细胞等多种免疫细胞表面,在固有免疫和适应性免疫应答中都起着非常重要的作用。近年来,UL16结合蛋白(ULBPs)作为一类新发现的人NKG2D配体家族日益受到关注。MULT1及其的剪切变体MULT1S,是ULBPs在小鼠的同类物,是小鼠的NKG2D配体。MULT1在正常的细胞膜上不表达或表达水平很低。在病理条件下,如在应激细胞、细菌或病毒感染细胞和肿瘤细胞,MULT1表达可上调,并通过与小鼠NKG2D受体结合,介导抗感染和肿瘤免疫。MULT1/MULT1S是跨膜蛋白,其胞内段较长,除了通过NKG2D受体介导抗感染和肿瘤免疫外,是否还具有其它功能,如是否与胸腺的发育有关,是否有反向的信号转导的功能以及抗原提呈细胞上是否会表达MULT1/MULT1S作为危险信号或作为协同刺激分子发挥作用,MULT1和MULT1S两者在功能上有何区别等问题,目前文献尚无报道,有必要进一步的研究。因此,我们建立了MULT1/MULT1S的转基因小鼠模型,旨在通过过表达MULT1/MULT1S,比较两种转基因小鼠MULT1/MULT1S在组织中的表达及其对免疫系统的影响,以了解它们的免疫学功能。本论文的第一部分主要是将构建的两个品系的转基因小鼠MULT1Tg (3’S和4’S)及3个品系的MULT1STg (7’S、10’S和41’S)与野生型C57BL／6小鼠交配,以产生Fl代小鼠,并对F1代小鼠进行基因型和表型的鉴定,为筛选符合进一步研究需要的转基因小鼠提供依据。通过提取F1代转基因小鼠的基因组DNA进行基因组PCR及Southern blotting,以鉴定转基因小鼠的基因型。结果获得鉴定阳性的小鼠3’S 25只、4’S 13只、7’S 16只、10’S 42只和41’S 9只。对小鼠尾部组织和尾血mRNA的实时定量RT-PCR检测结果表明,3’S和4’S品系的MULT1Tg小鼠以及10’S和41’S品系的MULT1STg小鼠的基因转录产物阳性,可用于进行下一步研究。应用流式细胞分析以及免疫组化对MULT1Tg小鼠多种组织细胞进行初步分析的结果显示,MULT1主要表达在胸腺和小肠上皮间淋巴细胞,在脾细胞上基本不表达,且在小肠上皮间淋巴细胞表面的表达与小鼠的年龄有关。这提示下一步研究应主要开展胸腺、肠道及皮肤组织的相关研究。本文的第二部分是有关人γδT细胞对类脂A的识别机制的研究(此部分与崔永春博士共同完成)。首先,应用流式细胞术、3H-TdR掺入实验和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)染色方法分别检测了在加与不加单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived dendritic cell, moDC)的条件下,类脂A诱导人外周血来源的γδT细胞的增殖情况。结果显示,当moDC存在时,LA能诱导人类γδT细胞明显增殖,而无moDC存在时,基本上观察不到γδT细胞有增殖现象。这提示γδT细胞仅识别由moDC递呈的LA抗原。其次,抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、TCRγδ、LA、MHCI和MHCⅡ抗体对LA诱导的γδT细胞增殖的阻断实验结果表明,只有抗CD1b、CD1c、TCRγδ和LA的抗体能明显阻断LA诱导的γδT细胞增殖,而其它抗体没有此阻断效应；提示γδT细胞对LA的识别,是由moDC细胞提呈,由moDC细胞上的CD1b和CD1c分子介导,并依赖于TCRγδ的过程。最后,对LA反应性γδT细胞的TCRγδCDR3区基因序列的测定结果,未见有特异性保守序列,但发现优势取用J1片段,尚需对其结合特性作进一步验证。上述发现丰富了对γδT细胞识别脂类抗原机制的认识。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
英文缩略词表  8-10
前言  10-12
第一部分 MULT1和MULT1S转基因小鼠的鉴定和初步分析  12-40
  实验材料和方法  12-23
  实验结果  23-36
  讨论  36-39
  结论  39-40
第二部分:γδT细胞对类脂A识别机制的研究  40-56
  实验材料和方法  40-48
  实验结果  48-54
  讨论  54-55
  结论  55-56
参考文献  56-59
综述  59-67
个人简历  67-68
致谢  68-69

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