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大肠杆菌中类脂A分子结构的定向改造

作　者: 陈久洲
导　师: 王小元
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 内毒素脂多糖类脂A MPL 疫苗佐剂食品安全
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

类脂A是革兰氏阴性细菌细胞外膜外侧脂多糖的主要组成成分,也是内毒素的活性成分,可以被宿主免疫细胞识别并引发体内的病原反应。类脂A的合成途径相对保守,但在转运到外膜外侧的过程中它的结构会发生不同的修饰作用以适应不同的外界环境。类脂A的结构修饰在细菌体内受到的调控非常严谨且与细菌的致病性密切相关,却不影响细菌的生长繁殖。本课题立足于该领域的最新研究进展,以野生型大肠杆菌的类脂A分子为研究对象,以疫苗佐剂 MPL为类脂A定向改造的最终目标,对大肠杆菌中类脂A分子结构的修饰进行了一定的研究,取得的主要成果如下：(1)分别构建了重组载体pWSK29-pagL和pWSK29-pagP,对PagL和PagP在大肠杆菌W3110中的表达及其对类脂A的修饰进行了初步的研究,结果发现虽然二者均为与类脂A脂肪酸链修饰相关的细胞外膜蛋白,但是在W3110中表达后它们对类脂A结构的修饰作用相差却很大：PagL表达后能催化绝大部分类脂A的脱酰基化,而PagP表达后对类脂A结构的修饰作用却非常有限,说明与PagL的修饰作用相比,大肠杆菌的pagP基因不但受到PhoP-PhoQ转录水平的调控,其表达产物PagP的活性也受到其他外界条件的影响。(2)构建了三个目的基因共表达的重组载体pWSK29-pagL-lpxE-pagP,实现了MPL的大肠杆菌体内合成,但是菌株中类脂A的成分比较复杂,含有四种经过修饰的类脂A结构,其中MPL的比例较小(3)建立了一种简单快速高效的用于外源基因在大肠杆菌染色体lacZ位点上整合表达的新方法,选用cat作为报告基因验证了该方法的可行性,结果表明大肠杆菌突变株W3110-cat具有氯霉素的抗性但对卡那霉素敏感,说明cat基因在染色体上可以正常表达并去除了用于筛选的抗性标记。该方法的建立为类脂A结构的定向改造提供了一种不依赖于载体的新途径。(4)利用上述染色体整合表达的方法构建了三种大肠杆菌突变株CW001、CW002和CW004:CW001的染色体上整合有来自弗朗西斯菌的lpxE基因,IPTG诱导的条件下几乎所有的类脂A都被单磷酸类脂A代替,为单磷酸类脂A衍生物的开发提供了良好的出发菌株；CW002的染色体上整合有来自沙门氏菌的pagL基因和来自弗朗西斯菌的lpxE基因,类脂A结构分析发现CW002中类脂A发生了相应的结构修饰；而CW004的染色体上整合有kan启动子控制的三个目的基因pagL、lpxE和pagP,类脂A结构鉴定结果显示该突变株能够合成MPL且其比例与载体表达时基本相同。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章引言  7-15
  1.1 类脂A和内毒素  7-8
    1.1.1 内毒素的结构  7
    1.1.2 内毒素的功能  7-8
  1.2 类脂A及LPS的合成  8-9
  1.3 类脂A的修饰  9-13
    1.3.1 类脂A结构修饰的调控  9-10
    1.3.2 类脂A脂肪酸链的修饰  10-12
    1.3.3 类脂A磷酸基团的修饰  12-13
    1.3.4 类脂A结构中磷酸基团和脂肪酸链的相互影响  13
  1.4 立题背景和意义  13-14
  1.5 课题研究内容和研究目标  14-15
第二章实验材料与方法  15-26
  2.1 实验材料  15-17
    2.1.1 菌株、质粒、引物和细菌培养  15-16
    2.1.2 工具酶和试剂  16
    2.1.3 主要仪器  16-17
  2.2 分子生物学基本操作  17-19
    2.2.1 质粒及基因组DNA提取  17
    2.2.2 PCR反应体系和条件  17
    2.2.3 质粒和PCR产物的酶切连接  17-19
  2.3 载体依赖的大肠杆菌类脂A结构的定向改造  19-20
    2.3.1 类脂A结构修饰基因表达载体的构建  19
    2.3.2 类脂A的提取及TLC分析  19-20
    2.3.3 类脂A结构的ESI/MS分析  20
    2.3.4 菌株类脂A结构修饰优化试验  20
  2.4 大肠杆菌单磷酸类脂A突变株的构建及染色体整合表达方法的建立  20-23
    2.4.1 lpxE整合敲入片段的构建  21-22
    2.4.2 敲除感受态的制备及电转化  22
    2.4.3 突变株验证及抗性标记的去除  22
    2.4.4 类脂A提取及结构分析  22
    2.4.5 CW001生长状态及外源基因lpxE的稳定性的研究  22
    2.4.6 报告基因cat的敲入表达及染色体整合表达方法的建立  22-23
  2.5 不依赖于载体的大肠杆菌类脂A结构的定向改造  23-26
    2.5.1 pWSK29-QpagL-QlpxE的构建及表达分析  23
    2.5.2 pWSK29-pagL-lpxE的构建及染色体整合表达  23
    2.5.3 大肠杆菌pagP缺失突变株的构建  23-25
    2.5.5 pWSK29-P_(kan)-pagL-lpxE-pagP的构建及敲入表达分析  25-26
第三章结果与讨论  26-46
  3.1 类脂A结构定向改造的初步研究  26-30
    3.1.1 PagL和PagP表达载体的构建  26
    3.1.2 PagL和PagP对类脂A结构的修饰  26-28
    3.1.3 PagL、LpxE和PagP的共表达表达及MPL的产生  28-29
    3.1.4 阶段小结  29-30
  3.2 类脂A结构修饰的优化  30-34
    3.2.1 沙门氏菌pagP基因的表达及其对类脂A的结构修饰  30-31
    3.2.2 表达载体pBAD24对目的基因表达及类脂A结构修饰的研究  31-32
    3.2.3 目的基因表达的双启动子组成型改造及其对类脂A结构的修饰  32-33
    3.2.5 阶段小结  33-34
  3.3 大肠杆菌单磷酸类脂A突变株的构建及染色体整合表达方法的建立  34-39
    3.3.1 大肠杆菌MPLA突变株CW001的构建  34-35
    3.3.2 突变株CW001中类脂A结构的分析  35
    3.3.3 CW001生长曲线和lpxE的稳定性  35-37
    3.3.4 大肠杆菌染色体快速整合表达方法的建立  37-39
    3.3.5 阶段小结  39
  3.4 不依赖于载体的大肠杆菌类脂A结构的定向改造  39-46
    3.4.1 带有自身启动子的pagL和lpxE在大肠杆菌中的作用  39-40
    3.4.2 pagL和lpxE染色体整合表达突变株CW002的构建及其对类脂A结构的分析  40-41
    3.4.3 大肠杆菌pagP缺失突变株CW003的构建  41-42
    3.4.4 双启动子组成型突变株CW004的构建及其类脂A结构的分析  42-44
    3.4.5 阶段小结  44-46
第四章结论与展望  46-48
  4.1 结论  46
  4.2 展望  46-48
致谢  48-49
参考文献  49-55
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  55

大肠杆菌中类脂A分子结构的定向改造

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