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CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞体外迁移实验

作　者: 张悦
导　师: 高年发
学　校: 天津科技大学
专　业: 生物化工
关键词: 骨髓间充质干细胞 CXCR4 SDF-1 逆转录病毒迁移
分类号: R542.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本文旨在构建一种高表达CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),考察CXCR4对细胞定向迁移能力的影响。MSCs常用于心肌梗死后的心肌修复,研究表明损伤的心肌组织高表达SDF-1,而MSCs表面表达CXCR4,依靠配体与受体的亲和,使MSCs靶向迁移到梗塞部位,参与组织修复。尽管在体外培养过程中发现部分MSCs膜表面有CXCR4的表达,但表达水平低,并且绝大多数干细胞不表达CXCR4。所以本实验拟采用逆转录病毒转导CXCR4基因的方式,增加MSCs表面CXCR4的表达量,来加强细胞的迁移速度和数量。对提高MSCs治疗心肌坏死起到积极的效果。本文通过密度梯度离心法分离出大鼠的骨髓单核细胞,通过贴壁法建立MSCs的体外培养体系,并对所培养的细胞进行鉴定。免疫染色鉴定CD106、CD29、CD44都表达呈阳性,结果显示MSCs分离培养成功。论文运用基因工程学方法构建pMSCV-IRES-CXCR4-GFP和pMSCV-neor-CXCR4两种逆转录病毒载体。测序表明其所携带的CXCR4 cDNA与GeneBank公布的序列一致,定向构建的逆转录病毒载体连接方向和开放阅读框正确,证明载体构建成功。两种质粒用磷酸钙法转染293T包装病毒,并用制备好的病毒感染MSCs。通过免疫细胞染色及流式细胞仪(FCM)检测比较两种质粒的转导效率。结果表明pMSCV-neor-CXCR4修饰的MSCs中抗体染色后的CXCR4红色荧光表达量为19.8%,而pMSCV-IRES-CXCR4-GFP中表达量为44.8%,并进一步通过RT-PCR的方法从mRNA水平检测到CXCR4基因在MSCs中表达。因此,选取pMSCV-CXCR4-IRES-GFP进行后续实验。运用transwell检测转基因MSCs在不同浓度SDF-1诱导下的靶向迁移效率。Transwell实验结果显示,CXCR4基因修饰的MSCs,向SDF-1的迁移能力得到显著增强,浓度在50ng/mL时为最佳迁移浓度,加入CXCR4阻断型抗体AMD3100可有效抑制基因修饰细胞的迁移。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-17
  1.1 心肌梗死的背景  9
  1.2 心肌梗塞与干细胞的疗法  9-14
    1.2.1 胚胎干细胞  10
    1.2.2 成体干细胞  10
    1.2.3 造血干细胞  10-11
    1.2.4 内皮祖细胞  11-12
    1.2.5 多能成体祖细胞  12
    1.2.6 骨骼肌成肌细胞  12
    1.2.7 心肌祖细胞  12-13
    1.2.8 间充质细胞  13-14
  1.3 骨髓干细胞的归巢及SDF-1/CXCR4轴在归巢中的作用  14-16
    1.3.1 干细胞的归巢  14
    1.3.2 SDF-1/CXCR4轴在骨髓干细胞迁移和归巢的作用  14-15
    1.3.3 SDF-1/CXCR4轴在心肌梗死治疗中的应用  15-16
  1.4 本论文研究的主要内容、目的及意义  16-17
    1.4.1 本论文研究的目的及意义  16
    1.4.2 本论文研究的主要内容  16-17
2 材料与方法  17-34
  2.1 实验材料  17-20
    2.1.1 实验动物  17
    2.1.2 实验仪器  17
    2.1.3 主要试剂  17-18
    2.1.4 主要试剂的配制  18-20
  2.2 实验方法  20-34
    2.2.1 MSCs的培养与鉴定  20-22
    2.2.2 CXCR4基因逆转录病毒表达载体的构建  22-28
    2.2.3 CXCR4体外转染MSCs及转染后MSCs的表达检测  28-33
    2.2.4 CXCR4/SDF-1轴的体外靶向性实验  33-34
3 结果与讨论  34-62
  3.1 MSCs的鉴定  34-37
    3.1.1 形态特征  34-35
    3.1.2 MSCs的免疫染色鉴定结果  35-36
    3.1.3 MSCs的生长动力学检测  36
    3.1.4 MSCs的冻存与复苏  36
    3.1.5 本节讨论  36-37
  3.2 CXCR4逆转录病毒质粒的构建  37-48
    3.2.1 逆转录病毒一的目的基因片断CXCR4的酶切及回收  37-38
    3.2.2 载体质粒pMSCV-IRES-GFP的补平反应及回收  38-39
    3.2.3 pMSCV-GFP与CXCR4的连接及双酶切鉴定  39-40
    3.2.4 重组质粒pMSCV-CXCR4-IRES-GFP的PCR鉴定  40
    3.2.5 重组质粒pMSCV-CXCR4-IRES-GFP的CXCR4基因片段测序  40
    3.2.6 逆转录病毒二的目的基因片断CXCR4的酶切及回收  40-41
    3.2.7 中间载体质粒pBlue-script的补平反应及回收  41-42
    3.2.8 pBlue-script与和hCXCR4的连接及双酶切鉴定  42
    3.2.9 载体质粒pMSCV-neo~r的双酶切反应及回收  42-43
    3.2.10 pMSCV-neo~r与CXCR4的连接及双酶切鉴定  43-44
    3.2.11 重组质粒pMSCV-neo~r-CXCR4的PCR鉴定  44-45
    3.2.12 重组质粒pMSCV-neo~r-CXCR4的CXCR4基因片段的测序  45
    3.2.13 本节讨论  45-48
  3.3 两种CXCR4基因质粒体外修饰MSCs及转导效率的比较  48-56
    3.3.1 质粒的纯度及浓度检测  48
    3.3.2 病毒的制备  48-49
    3.3.3 逆转录病毒感染大鼠的MSCs并进行转导效率的比较  49-53
    3.3.4 RT-PCR检测CXCR4基因修饰的MSCs表达  53
    3.3.5 基因修饰的MSCs生长动力学检测  53-54
    3.3.6 本节讨论  54-56
  3.4 SDF-1对CXCR4的体外靶向作用  56-62
    3.4.1 transwell细胞体外穿越试验  56-57
    3.4.2 CXCR4阻断型抗体AMD3100对MSCs迁移的影响  57-58
    3.4.3 无血清条件下SDF-1/CXCR4轴对MSCs凋亡的影响  58-60
    3.4.4 本节讨论  60-62
4 结论  62-63
  4.1 结论  62
  4.2 论文创新点  62-63
5 展望  63-64
6 参考文献  64-71
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  71-72
8 致谢  72

CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞体外迁移实验

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