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猪胚胎玻璃化冷冻及胚胎生产技术的研究

作　者: 杨山亭
导　师: 张德福；徐银学
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪孤雌激活体外受精超数排卵玻璃化冷冻
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目前,猪胚胎的冷冻保存尚未取得突破性进展,冷冻程序需进一步改善。建立和完善猪胚胎冷冻体系,一方面可以为猪种质资源保存及濒临动物的保护提供新的途径；另一方面为加快繁殖新技术的应用及丰富发育生物学文库,具有重要的理论意义和实用价值。本研究旨在通过体外受精、孤雌激活和超数排卵等技术,建立简便、有效的猪胚胎生产技术体系,同时为优化和完善猪胚胎冷冻体系奠定基础。猪卵母细胞孤雌激活试验表明,激活液中Ca2+浓度为0.10mM,电脉冲强度为1.2kV/cm时卵裂率(80.70%)和囊胚率(11.94%)效果最好；当Ca2+浓度达到0.50mM时,卵裂率(61.40%)和囊胚率(7.84%)都显著下降,退化率也显著增加,其他各组差异显著(P<0.05)。化学激活采用7.5μg/mLCB+10μg/mL CHX+2mM6-DMAP联合处理组卵母细胞激活后卵裂率(92.80%)和囊胚发育率(49.10%)最高,与其他各组差异显著(P<0.05)。以解冻后活力为0.3左右的冷冻精液进行体外受精试验,精子浓度以107／mL为宜；0.25ml细管冷冻精液IVF的卵裂率显著低于鲜精(P<0.05),但是囊胚率差异不显著(P>0.05)；在受精滴中(mTBM)中添加5mM的Caffeine,其卵裂率和囊胚率都有所提高,与对照组差异不显著(P>0.05)。在猪的超数排卵试验中,通过注射PG+PMSG+hCG母猪的同期发情效果最好,12头试验母猪同期发情率为91.7%,平均采集胚胎数为19.2枚,与其他组别差异不显著(P>0.05)。另外,激素剂量大小直接影响超排效果,在PMSG剂量为1000IU, hCG为500IU时超排效果最好,9头母猪同期发情率达到了100%,当PMSG剂量增加时,超排效果不随之提高。在合适的超排周期实施超排技术能达到达理想的效果,在发情周期的第14d、15d进行超排效果最好,其发情率和囊胚回收数均高于其他组别,差异不显著(P>0.05)。本试验系统的比较了不同的冷冻方法、冷冻预处理方案以及冷冻载体对卵母细胞和胚胎冷冻效果的影响。三种不同的冷冻载体即开放式拉长细管法(Open-pulled straws, OPS)、细管法(Straw)和冷冻环法(Cryo-loop vitrfication, CLV),结果表明,CLV法冷冻卵母细胞和胚胎效果较好。冷冻-解冻胚胎培养24小时后,CLV法存活率达到86.70%,高于OPS法(83.80%)和Straw法(77.60%)；囊胚细胞数(56.3)也高于OPS法和Straw法,三者之间差异不显著(P>0.05)。卵母冷冻解冻后的卵裂率CLV法(7.22%)与OPS法、Straw法(4.85%、0%)相比差异显著(P<0.05)；形态正常率为(84.35%)及FDA染色存活率为(80.00%)与其他各组差异显著(P<0.05)；经紫杉醇和cB预处理后的卵母细胞其形态正常率分别为(87.94%,84.89%)与对照组无显著差异(P>0.05)；经cB处理或者cB处理+离心极化等操作再进行玻璃化冷冻,其冷冻效果不明显,与对照组之间差异不显著(P>0.05),经去脂操作再进行玻璃化冷冻,其形态正常率和染色存活率都明显低于对照组差异显著(P<0.05)。对胚胎进行透明带薄化处理(0.50%链蛋白酶10 s),虽然对胚胎存活率没有显著影响,但能显著提高囊胚细胞数(60.1)与对照组(46.6)相比差异显著(P<0.05)。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
引言  12-13
第一部分文献综述  13-26
  1 胚胎冷冻保存的意义和进展  13
  2 胚胎的冷冻保存及损伤机理  13-15
  3 胚胎冷冻保存方法  15-19
    3.1 程序化冷冻  15
      3.1.1 慢速冷冻法  15
      3.1.2 快速冷冻法  15
    3.2 玻璃化冷冻法  15-19
      3.2.1 常规玻璃化冷冻  16-19
      3.2.2 超快速玻璃化  19
  4 冷冻保存对卵母细胞与胚胎的影响  19-21
    4.1 对细胞骨架的影响  19-20
    4.2 细胞膜的损伤  20
    4.3 对染色体的影响  20-21
    4.4 对透明带的影响  21
  5 影响胚胎和卵母细胞冷冻效果的因素  21-24
    5.1 卵母细胞的特殊结构及种别  21-22
    5.2 卵母细胞发育阶段  22
    5.3 胚胎细胞质内脂肪滴的影响  22
    5.4 冷冻保护剂的选择  22-24
  6 冷冻保存存在的问题和展望  24-26
第二部分实验研究  26-50
  第一章猪卵母细胞体外受精和孤雌激活技术的优化  26-38
    1 材料与方法  26-32
      1.1 材料  26-29
      1.2 方法  29-32
      1.3 数据统计  32
    2 结果与分析  32-35
      2.1 精子密度对体外受精效果的影响  32
      2.2 咖啡因(Caffeine)浓度对体外受精的影响  32-33
      2.3 冻精和鲜精对受精效果的影响  33
      2.4 Ca~(2+)浓度的不同对猪卵母细胞孤雌激活的影响  33-34
      2.5 6-DMAP、CB、CHX联合处理对猪卵母细胞孤雌激活的影响  34-35
    3 讨论  35-38
      3.1 精子密度对体外受精效果的影响  35
      3.2 咖啡因浓度对体外受精的影响  35-36
      3.3 冻精和鲜精受精能力的比较  36
      3.4 不同Ca~(2+)浓度对猪卵母细胞孤雌激活的影响  36-37
      3.5 6-DMAP、CB、CHX联合处理对猪卵母细胞孤雌激活的影响  37-38
  第二章影响猪超数排卵效果的因素分析  38-42
    1 材料与方法  38-39
      1.1 试验动物与试剂  38
      1.2 超排处理  38
      1.3 胚胎的手术回收  38-39
      1.4 数据处理  39
    2 结果与分析  39-41
      2.1 不同的处理方法对超排效果的影响  39-40
      2.2 不同激素剂量对超排效果的影响  40
      2.3 不同超排时间对超排效果的影响  40-41
    3 讨论  41-42
  第三章猪卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法的改进  42-50
    1 材料与方法  42-44
      1.1 试验材料  42-43
      1.2 试验方法  43-44
      1.3 冷冻-解冻卵母细胞和胚胎的鉴定  44
      1.4 数据统计  44
    2 结果与分析  44-47
      2.1 不同玻璃化冷冻载体对卵母细胞冷冻效果的影响  44-45
      2.2 紫杉醇(Taxol)和CB预处理对冷冻环冷冻效果的影响  45
      2.3 离心与去脂后冷冻对冷冻效果的影响  45-46
      2.4 不同玻璃化冷冻载体对胚胎冷冻效果的影响  46
      2.5 透明带处理对猪胚胎存活率的影响  46-47
    3 讨论  47-50
      3.1 不同玻璃化冷冻方法对卵母细胞和胚胎冷冻效果的影响  47-48
      3.2 紫杉醇和cB预处理对冷冻环冷冻效果的影响  48
      3.3 离心与去脂后冷冻对冷冻效果的影响  48-49
      3.4 透明带处理对猪胚胎存活率的影响  49-50
参考文献  50-58
全文总结  58-59
附录  59-61
攻读学位期间发表的学术论文目录  61-62
致谢  62

猪胚胎玻璃化冷冻及胚胎生产技术的研究

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