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禽流感病毒H3N8野鸭分离株分子生物学特征研究及遗传进化分析

作　者: 郭亮
导　师: 华育平
学　校: 东北林业大学
专　业: 生理学
关键词: 禽流感H3N8亚型病毒 基因克隆 野鸭分离株 分子特征
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 62次
引　用: 1次
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内容摘要


多年来本实验室开展了野鸟流行病学监测工作。2006年秋季,从黑龙江省三江国家级自然保护区采集了93个样品,其中分别由两只健康绿头鸭体内分离到2株具有血凝性的病毒,经本实验室确认并经国家禽流感参考实验室鉴定,确定其均为禽流感病毒H3N8亚型,并命名为A/Mallard/SanJiang/98/2006（H3N8）和A/Mallard/SanJiang/167/2006（H3N8）。本论文对这两株分离株进行了全基因组序列测定,并研究其基因特征及遗传演化关系。本研究采用无特定病原体（SPF）鸡胚增殖禽流感病毒野鸭源分离株MSJ98/06和MSJ167/06,从鸡胚尿囊液中提取病毒基因组总RNA,参考GeneBank已发表的H3N8亚型AIV各段基因的核苷酸序列,利用分子生物学软件设计并合成了14对特异性引物,用RT-PCR技术分别扩增MSJ98/06和MSJ167/06分离株的8个基因节段的cDNA（其中HA、PA、PB1、PB2基因均分为两段扩增）。PCR产物经回收纯化后连接到PMD18-T载体上,将连接产物转入DH5-a感受态细胞中,重组质粒经PCR鉴定为阳性后,进行序列测定。序列测定正确后,与国内外H3N8亚型的部分分离株的相应基因及其推导的氨基酸序列进行同源性比较和遗传进化分析。序列分析结果表明,所得到的两株AIV的8个节段均含有完整的开放阅读框架以及5′端和3′端的非编码区序列。根据测得的基因序列绘制遗传进化树发现两个分离株的大部分基因与韩国地区分离株、日本北海道分离株以及中国大陆南昌分离株的亲缘关系密切,有着相似的遗传演化过程,可能具有共同祖先。与北美和澳大利亚的禽源分离株亲缘关系较远,在地理分布上表现出明显的差异。且与所有马源分离株的核苷酸同源率仅有70%左右,说明H3N8亚型流感病毒具有明显的种属差异性。而两株H3N8亚型禽流感分离株的NA基因核苷酸同源率仅有77.3%,差异较大。NS基因分析表明,本研究的两个分离株应属于欧亚禽一马群。HA基因裂解位点处的氨基酸序列分别为340PEKQTR↓SLF348和340PEKQTR↓GLF348,与低致病性禽流感的HA的裂解位点相一致,且已有的研究不支持H3N8亚型禽流感病毒对禽类具有高度致病力,可以推断分离株MSJ98/06和MSJ167/06为非高致病力毒株。由于从野生中分离出H3N8亚型禽流感病毒在我国尚无报道,所以本研究的两株H3N8亚型禽流感病毒全基因的克隆及序列分析结果,对于禽流感的深入研究,特别是对野生水禽禽流感病毒的携带状况和分子流行病学的研究具有重要的参考价值。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-20
  1.1 课题背景(或引言)  9
  1.2 禽流感病毒的研究进展  9-18
    1.2.1 禽流感病毒的发现及其发展历史  9-10
    1.2.2 禽流感病毒的分类及形态  10
    1.2.3 禽流感病毒的命名  10-11
    1.2.4 禽流感病毒的理化特征  11
    1.2.5 禽流感病毒的流行病学研究  11-12
    1.2.6 流感病毒基因组的及其编码的蛋白功能  12-17
    1.2.7 病毒的复制  17
    1.2.8 禽流感病毒的抗原变异  17-18
    1.2.9 LPAIV向HPAIV的转变  18
  1.3 本课题研究的目的和意义  18-20
2 材料和方法  20-27
  2.1 实验材料  20-21
    2.1.1 毒株  20
    2.1.2 SPF鸡胚及红细胞  20
    2.1.3 受体菌  20
    2.1.4 实验试剂  20
    2.1.5 实验仪器  20-21
    2.1.6 特异性引物  21
  2.2 实验方法  21-27
    2.2.1 样品的采集和病毒的分离  21-22
    2.2.2 红细胞凝集实验(HA)  22
    2.2.3 病毒RNA的提取  22-23
    2.2.4 cDNA的合成  23
    2.2.5 AIV的RT-PCR检测  23
    2.2.6 PCR结果鉴定  23-24
    2.2.7 AIV血凝素亚型及神经氨酸酶亚型的鉴定  24
    2.2.8 全基因组PCR扩增  24
    2.2.9 PCR产物的克隆  24-26
    2.2.10 PCR方法鉴定重组质粒  26
    2.2.11 序列测定  26
    2.2.12 序列比较分析  26-27
3 结果  27-62
  3.1 血凝价  27
  3.2 AIV阳性样品PCR检测结果  27
  3.3 RT-PCR电泳结果  27-32
  3.4 A/Mallard/SanJiang/98/2006(H3N8)基因组序列  32-39
  3.5 A/Mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)基因组序列  39-47
  3.6 两株H3N8亚型AIV分离株遗传进化树绘制  47-56
    3.6.1 血凝素基因(HA)遗传进化树  47-49
    3.6.2 神经氨酸酶基因(NA)遗传进化树  49-50
    3.6.3 RNA聚合酶基因(PB2,PB1,PA)遗传进化树  50-53
    3.6.4 核糖核蛋白基因(NP)遗传进化树  53-54
    3.6.5 基质蛋白基因(M)遗传进化树  54-55
    3.6.6 非结构蛋白基因(NS)遗传进化树  55-56
  3.7 两分离株与H3N8亚型AIV基因组序列同源性比较  56-58
  3.8 血凝素基因(HA)序列比较  58-60
  3.9 神经氨酸酶基因(NA)潜在糖基化位点  60
  3.10 基质蛋白(M)离子通道氨基酸位点比较  60-62
4 讨论  62-69
  4.1 基因组分析  62-67
    4.1.1 分离株HA基因特征及其遗传进化关系  62-63
    4.1.2 分离株NA基因特征及其进化关系  63-64
    4.1.3 分离株NS基因的特征及其进化关系  64-65
    4.1.4 分离株聚合酶基因的特征及其进化关系  65-66
    4.1.5 分离株NP和M基因的特征及其进化关系  66-67
  4.2 野鸟在AIV传播中的作用的初步探讨  67-69
5 结论  69-70
参考文献  70-76
攻读学位期间发表的学术论文  76-77
致谢  77-78

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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