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家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因的表达谱分析

作　者: 陈惠娟
导　师: 李飞
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 家蚕乙酰胆碱酯酶 Bm-ace1 Bm-ace2 表达量荧光定量PCR 双倒数曲线转录因子结合位点
分类号: S881.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 23次
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内容摘要

昆虫中多种乙酰胆碱酯酶基因的存在,使不同乙酰胆碱酯酶的表达谱和功能研究成为热点之一。家蚕也存在两种乙酰胆碱酯酶基因：Bm-ace1, Bm-ace2.由于家蚕特殊的经济价值,加之其基因组序列已经公布,家蚕已经作为一种模式生物被广泛运用于分子生物学及生物信息学研究中。本课题的研究重点主要利用荧光定量PCR、生化试验、生物信息学方法对家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因的表达谱及生化特性进行系统地研究。主要内容及研究结果如下：1)运用荧光定量PCR技术测定家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因在不同发育阶段(1-5龄、蛹、成虫、卵)及同一龄期不同日龄的表达量。结果表明,Bm-ace2表达量在所有发育阶段都明显高于Bm-ace1, Bm-ace2/Bm-ace1的比例为2.92.64.75,成虫阶段尤其雄虫的差异最大。这与已报道的农业昆虫结果相反,已有的研究表明在多种农业害虫中乙酰胆碱酯酶Ⅰ表达量明显高于乙酰胆碱酯酶Ⅱ。分析认为在对昆虫多种乙酰胆碱酯酶基因的进化选择上存在多样性。由于特殊的生存环境,家蚕选择了ace2,而其他害虫选择了ace1。两种基因在不同发育阶段各自的表达趋势有差异,Bm-ace1在1龄幼虫表达最高,卵期表达最低,其他阶段差异不明显；Bm-ace2在卵期表达最低,在雄虫表达高于幼虫和雌虫。在3龄不同日龄幼虫,Bm-ace1表达量高峰出现在龄期初期(1天)、龄期中间(3天)和龄期末(5天)；Bm-ace2的表达趋势为第1-3天逐天上升,第3-5天逐天下降。根据定量结果,Bm-ace2在3龄中的表达量一直高于Bm-ace1. Bm-ace2/Bm-ace1的比例存在动态变化,最高峰出现在第2天,之后逐渐下降,即两种酯酶基本表达量差量逐天减小。在家蚕头部、消化道、马氏管、丝腺、卵巢、精巢中,两种ace基因均有表达,并且两种基因在不同的组织中表达量存在差异。在头部中两种酶都高表达,Bm-ace1在丝腺中也较高,Bm-ace2在生殖器官(卵巢和精巢)中高表达。推测除主要的水解乙酰胆碱功能外,两种乙酰胆碱酯酶可能存在其他非水解酶的功能。另外,与不同龄期中的表达一致,Bm-ace2表达量明显高于Bm-ace1。在精巢中Bm-ace2/Bm-ace1比值最高,在头部比值最低。2)运用家蚕1、3龄不同日龄试虫粗酶液测定AChE酶活力及Km、Vm生化参数测定。结果表明,三龄幼虫不同日龄试虫酶活力成动态变化,1-3天逐渐升高,3-5龄逐渐下降,这与Bm-ace2基因的mRNA表达量趋势一致,而与Bm-ace1基因不一致,进一步证明Bm-ace2基因在家蚕体内占主导作用。在运用双倒数曲线计算Km、Vm时,发现在1、3龄不同日龄试虫的双倒数曲线不一致。这表明不同日龄试虫的AChE混合酶液的蛋白组分明显不同,这一方面是由于粗酶液是两种酶的混合物,另一方面是由两种酶不同时间的动态变化引起的。试验结果表明,在存在多种乙酰胆碱酯酶基因的昆虫中,运用粗酶液进行酶动力学测定的传统方法不能够正确反应酶生化特性,必须将多种AChE酶分别纯化后测定其生化特性参数。3)通过生物信息学软件TESS预测Bm-ace1、Bm-ace2转录因子结合核心区域上转录因子结合位点。在Bm-ace1的启动子区,预测到37个转录因子结合位点,而Bm-ace2的启动子区预测到33个结合位点。在这些位点中,两个基因共同的结合位点只有15个。两个基因拥有各自独特的转录因子结合位点,推测这些不同结合位点上结合的转录因子可能是引起家蚕两个乙酰胆碱酯酶基因表达量差异的重要原因之一。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词中英文对照  11-13
第一章文献综述  13-35
  1 昆虫体内存在多种乙酰胆碱酯酶  13-19
    1.1 果蝇体内只存在一种ace基因  14
    1.2 尖音库蚊体内两个ace基因的存在  14
    1.3 冈比亚按蚊体内两个ace基因的存在  14
    1.4 蚜虫及其他农业害虫体内存在多种ace基因  14-18
    1.5 昆虫乙酰胆碱酯酶基因分子进化分析  18-19
  2 乙酰胆碱酯酶与昆虫抗药性关系  19-23
    2.1 AChE的动力学参数  19-20
    2.2 两种乙酰胆碱酯酶与昆虫抗药性  20-22
    2.3 AChE量变与昆虫抗药性  22-23
  3 家蚕中两个乙酰胆碱酯酶基因研究进展  23-27
    3.1 家蚕两个乙酰胆碱酯酶基因的发现及基因结构  23-24
    3.2 家蚕两个乙酰胆碱酯酶基因cDNA序列及推导的蛋白序列  24-26
    3.3 家蚕ace基因氨基酸序列与其他物种相似性比对  26-27
  4 家蚕的研究简介  27-28
    4.1 家蚕生物学特性  27
    4.2 家蚕饲养环境简介  27-28
      4.2.1 严格控制温湿度  27-28
      4.2.2 严格消毒防病  28
    4.3 家蚕对农药的敏感性  28
  5 定量PCR研究技术应用现状及前景  28-32
    5.1 Real-time qPCR技术原理  29-30
    5.2 Real-time PCR技术实验方法  30-32
      5.2.1 SYBR green Ⅰ染料法  30-31
      5.2.2 TaqMan系统  31
      5.2.3 分子信标(molecular beacon)  31-32
  6 本研究目的和意义  32-33
  7 研究内容及技术路线  33-35
第二章家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因的表达谱分析  35-55
  1 材料与方法  37-44
    1.1 昆虫饲养及试虫材料提取  37
    1.2 主要试剂和仪器  37-38
      1.2.1 主要试剂  37
      1.2.2 主要仪器设备  37-38
    1.3 总RNA提取和cDNA合成  38-39
      1.3.1 总RNA提取  38-39
      1.3.2 cDNA合成  39
    1.4 PCR引物  39-40
    1.5 RT-PCR  40-41
    1.6 PCR产物回收与纯化  41
    1.7 连接反应  41
    1.8 连接产物的转化  41-42
    1.9 重组质粒的提取及检测  42
    1.10 序列测定与分析  42-43
    1.11 定量PCR分析  43-44
      1.11.1 定量PCR  43
      1.11.2 计算方法  43-44
      1.11.3 统计方法  44
  2 实验结果  44-52
    2.1 荧光定量PCR产物熔解曲线及扩增效率一致性分析  44-46
    2.2 两种乙酰胆碱酯酶基因在家蚕不同龄期表达情况  46-48
      2.2.1 两种乙酰胆碱酯酶存在于各个龄期  46
      2.2.2 Bm-ace2表达量高于Bm-ace1  46
      2.2.3 两种乙酰胆碱酯酶基因在不同发育阶段各自的表达趋势有差异  46-48
    2.3 在三龄幼虫不同日龄试虫中两种乙酰胆碱酯酶基因表达情况  48-50
      2.3.1 RT-PCR验证两个乙酰胆碱酯酶基因的存在  48
      2.3.2 荧光定量PCR测定三龄幼虫两种乙酰胆碱酯酶表达量情况  48-50
    2.4 在家蚕组织中两种乙酰胆碱酯酶基因表达情况  50-52
      2.4.1 两种乙酰胆碱酯酶在特异组织特性表达  50
      2.4.2 两种乙酰胆碱酯酶在特异组织中表达量分析  50
      2.4.3 Bm-ace2表达量在不同组织中均高与Bm-ace1  50-52
  3 讨论  52-55
第三章两种乙酰胆碱酯酶蛋白生化测定  55-61
  1 材料与方法  56-57
    1.1 昆虫饲养及材料获取  56
    1.2 试验仪器及试剂  56
      1.2.1 试剂  56
      1.2.2 仪器  56
    1.3 酶动力学参数测定  56-57
    1.4 统计方法  57
  2 实验结果  57-59
    2.1 酶活力测定  57-58
    2.2 双倒数曲线测定Km、V_(max)值  58-59
  3 讨论  59-61
第四章两种乙酰胆碱酯转录因子结合位点生物信息学分析  61-67
  1 材料与方法  62-63
    1.1 序列获取  62-63
  2 实验结果  63-65
  3 讨论  65-67
参考文献  67-75
附录:攻读硕士学位期间学术论文的发表情况  75-77
致谢  77

家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因的表达谱分析

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