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脂肪酶的固定化及其在2-氯丙酸拆分中的应用

作　者: 金迪
导　师: 施介华
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 2-氯丙酸 2-氯丙酸酯脂肪酶固定化手性拆分色谱分离
分类号: O621.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

2-氯丙酸是合成农药、染料和农林化学品的重要中间体，然而只有光学活性的2-氯丙酸合成的产品才具有较高的生理活性或药理作用。传统制备工艺都是由2-氯丙酸及其酯外消旋体为原料合成的农药和医药中间体，由于其含有低效或无效或有毒副作用的对映异构体，不仅活性较低，而且会加剧环境污染。因此，研究如何高效地获取光学活性的2-氯丙酸具有十分重要的意义。本文以2-氯丙酸为模型化合物，研究了猪胰脂肪酶(PPL)和解脂酵母脂肪酶(CLL)催化对映选择性酯水解反应制备该化合物的基本规律，确定了酶促拆分的最佳反应条件。为了克服游离酶催化的一些不足之处，将游离酶固定在载体上，寻求最佳的脂肪酶固定化方案，并将固定化酶应用于2-氯丙酸酯的拆分。最后对2-氯丙酸酯进行手性色谱分离，并对色谱拆分机理作了一定的探讨。实验结果表明，PPL和CLL水解拆分获得2-氯丙酸的主要构型是正好反向的，进一步研究了脂肪酶的微环境对其拆分的影响，得出PPL和CLL的催化活性和对映选择性与2-氯丙酸酯的醇单元链长有关，在水解的最适温度和最适pH下酶获得最高的催化活性，且在低温范围下酶的对映选择性较高。底物浓度的增加对反应的转化率以及产物的光学纯度均有抑制现象；而酶量加大在提高反应速率的同时由于缩短快慢反应的差异也使反应的选择性下降。筛选出以硅藻土为载体，载体涂布固定法制备固定化脂肪酶CLL，确定较佳的固定化条件为缓冲液pH7.2～7.6，浓度0.1mol／l，酶：载体=1：2，20～25℃下固定4～6h得到的固定化酶具有较高的水解活力，且固定化酶的酸碱稳定性和热稳定性较游离酶均有所提高。将固定化酶应用到催化拆分外消旋2-氯丙酸酯的反应中，固定化后仍保持了游离酶的催化拆分优势，当转化率≤50％时，仍能获得很高的对映体过量值，达到91％以上。将固定化酶用于催化水解反应的全过程来看，循环3次固定化酶仍能保持较高的活性，酶活达84.1％。最后对2-氯丙酸酯在七(2，3-二-O-甲基-6-叔-丁基二甲基硅烷)-β-环糊精(CycloSil-B)固定相的气相色谱上直接手性分离，将色谱保留参数lnα对1／T作图，得到拆分过程中的热力学数据，对拆分过程的熵焓补偿问题进行了研究。结果表明在实验范围内，2-氯丙酸酯在CycloSil-B柱上存在熵焓补偿关系，说明上述化合物在该固定相上的拆分机理或主导拆分机理是相同的。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一章文献综述  13-38
  1.1 手性药物概述  13-16
    1.1.1 手性  13
    1.1.2 手性药物  13-15
    1.1.3 手性药物的研究与发展  15-16
  1.2 手性化合物的制备方法  16-19
  1.3 酶在手性化合物制备中的应用  19-25
    1.3.1 脂肪酶概述  19-21
    1.3.2 脂肪酶的性质研究  21-23
      1.3.2.1 脂肪酶的催化特性  21-22
      1.3.2.2 脂肪酶的底物特异性  22-23
    1.3.3 脂肪酶在手性拆分与合成中的应用  23-25
      1.3.3.1 脂肪酶催化不对称水解反应  23
      1.3.3.2 脂肪酶催化不对称酯化反应  23-24
      1.3.3.3 脂肪酶催化酯交换反应  24-25
  1.4 酶的修饰及固定化  25-28
    1.4.1 固定化酶的优越性  25-26
    1.4.2 固定化载体  26
    1.4.3 酶固定化的方法  26-28
  1.5 2 -氯丙酸及其酯的拆分研究进展  28-37
    1.5.1 2-氯丙酸简介  28
    1.5.2 2-氯丙酸用途  28-29
    1.5.3 2-氯丙酸及其酯的拆分  29-37
      1.5.3.1 化学拆分法  29-30
      1.5.3.2 生物酶法拆分法  30-34
      1.5.3.3 色谱拆分法  34-36
      1.5.3.4 萃取拆分法  36
      1.5.3.5 结论  36-37
  1.6 本课题研究的意义和主要内容  37-38
第二章脂肪酶的固定化研究  38-51
  2.1 引言  38
  2.2 实验材料  38-39
    2.2.1 脂肪酶  38
    2.2.2 主要试剂  38-39
    2.2.3 仪器与设备  39
  2.3 实验方法  39-42
    2.3.1 溶液的配制  39-40
    2.3.2 载体的预处理  40-41
    2.3.3 酶的固定化方法  41
    2.3.4 脂肪酶的水解活力测定  41-42
  2.4 结果与讨论  42-50
    2.4.1 酶活性测定方法的确定  42-44
    2.4.2 脂肪酶的酶学性质研究  44
    2.4.3 酶固定化的研究  44-50
      2.4.3.1 酶固定化方法的选择  44-45
      2.4.3.2 载体的选择  45-46
      2.4.3.3 酶和载体的比例对酶固定化的影响  46
      2.4.3.4 吸附时间对酶固定化的影响  46-47
      2.4.3.5 固定化温度的影响  47-48
      2.4.3.6 缓冲液pH对固定化酶的影响  48
      2.4.3.7 固定化酶的酸碱稳定性  48-49
      2.4.3.8 固定化酶的热稳定性  49-50
  2.5 本章小结  50-51
第三章脂肪酶催化水解拆分2-氯丙酸的研究  51-72
  3.1 引言  51
  3.2 实验材料  51-52
    3.2.1 脂肪酶  51-52
    3.2.2 主要试剂  52
    3.2.3 仪器与设备  52
  3.3 实验方法  52-55
    3.3.1 溶液的配制  52
    3.3.2 外消旋2-氯丙酸酯的合成  52-54
    3.3.3 磷酸缓冲液中酶促反应  54
    3.2.4 底物转化率的测定方法-酸碱滴定法  54
    3.3.5 对映体过量值的测定方法-色谱分离法  54-55
  3.4 结果与讨论  55-70
    3.4.1 不同脂肪酶对2-氯丙酸甲酯拆分效果的影响  55-56
    3.4.2 脂肪酶PPL拆分2-氯丙酸酯的研究  56-64
      3.4.2.1 底物结构对脂肪酶PPL拆分的影响  56-57
      3.4.2.2 温度对脂肪酶PPL拆分的影响  57-58
      3.4.2.3 pH对脂肪酶PPL拆分的影响  58-60
      3.4.2.4 底物浓度对脂肪酶PPL拆分的影响  60-62
      3.4.2.5 脂肪酶量对拆分的影响  62-64
    3.4.3 脂肪酶CLL拆分2-氯丙酸酯的研究  64-70
      3.4.3.1 底物结构对脂肪酶 CLL拆分的影响  64
      3.4.3.2 温度对脂肪酶 CLL拆分的影响  64-66
      3.4.3.3 pH对脂肪酶CLL拆分的影响  66-67
      3.4.3.4 不同的缓冲溶液浓度对脂肪酶CLL拆分的影响  67-69
      3.4.3.5 有机溶剂对脂肪酶 CLL拆分的影响  69-70
  3.5 本章小结  70-72
第四章固定化脂肪酶催化拆分2-氯丙酸的研究  72-82
  4.1 引言  72
  4.2 实验材料  72-73
    4.2.1 脂肪酶  72
    4.2.2 主要试剂  72
    4.2.3 仪器与设备  72-73
  4.3 实验方法  73
    4.3.1 溶液的配制  73
    4.3.2 固定化酶的制备  73
    4.3.3 固定化酶促反应方法  73
  4.4 结果与讨论  73-81
    4.4.1 水解温度对酶拆分的影响  73-74
    4.4.2 缓冲液pH对酶拆分的影响  74-76
    4.4.3 固定化酶用量对酶拆分的影响  76-77
    4.4.4 有机溶剂对酶拆分的影响  77-78
    4.4.5 缓冲液与有机溶剂比例对酶拆分的影响  78-79
    4.4.6 酶拆分反应时间的影响  79-80
    4.4.7 固定化酶的重复拆分实验研究  80-81
  4.5 本章小结  81-82
第五章 2-氯丙酸酯的色谱分离及其机理研究  82-90
  5.1 引言  82
  5.2 实验材料  82-83
    5.2.1 主要试剂  82-83
    5.2.2 仪器与设备  83
  5.3 实验方法  83
    5.3.1 色谱分离条件  83
    5.3.2 甲烷气的制备  83
    5.3.3 死时间(t_M)的确定  83
  5.4 结果与讨论  83-89
    5.4.1 2-氯丙酸酯的气相色谱分离  83-86
    5.4.2 环糊精衍生物固定相手性拆分机理初探  86
    5.4.3 2-氯丙酸酯在环糊精衍生物固定相上的熵焓补偿研究  86-89
  5.5 本章小结  89-90
第六章结论与建议  90-92
  6.1 结论  90-91
  6.2 建议  91-92
参考文献  92-102
攻读硕士期间发表的学术论文  102-103
致谢  103

脂肪酶的固定化及其在2-氯丙酸拆分中的应用

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