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原生质体融合选育纤维素发酵产脂菌株

作　者: 徐新丽
导　师: 谢必峰
学　校: 福建师范大学
专　业: 发酵工程
关键词: 深黄被孢霉黑曲霉原生质体融合纤维素产油菌株
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

原生质体融合技术是通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合而达到杂交目的的基因重组技术。深黄被孢霉3.3410（Mortierella isabellina AS 3.3410）是油脂高产菌,但是不能直接利用纤维素,而黑曲霉SL2-111（Aspergillus niger SL2-111）有高纤维素酶活性,但是不能产生油脂。本实验通过原生质体融合技术筛选能直接利用纤维素原料的产油菌株。本研究的主要结果如下:（1）深黄被孢霉3.3410和黑曲霉SL2-111的原生质体制备和再生的方法。深黄被孢霉3.3410原生质体制备和再生条件是:采用0.8 mol/L MgSO₄·7H₂O作为渗透压稳定剂,培养20h的菌丝体在浓度为1.2%溶菌酶+0.5%纤维素酶+0.8%蜗牛酶的混合酶液中酶解4h,酶解温度为30℃,PDA高渗再生培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到6.3×10⁷个/mL,再生率达到25.1%。黑曲霉SL2-111原生质体制备和再生的条件是:采用0.8 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,培养12h的菌丝体在浓度为1.0%溶菌酶+1.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶的混合酶液中酶解4h,酶解温度为30℃,PDA高渗再生培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到7.2×10⁷个/mL,再生率达到28.6%。（2）深黄被孢霉3.3410和黑曲霉SL2-111的原生质体灭活的方法。分别用紫外灭活和热灭活方式对深黄被孢霉3.3410和黑曲霉SL2-111原生质体进行灭活。结果,深黄被孢霉3.3410在15W紫外灯距离10cm处照射15min或者在55℃恒温水浴锅中加热15min;黑曲霉SL2-111在15W紫外灯距离10cm处照射15min或者在55℃恒温水浴锅中加热20min,两亲株原生质体的灭活率也达到100%。（3）原生质体融合的方法。使用45%的PEG作为助融剂,对经紫外灭活的深黄被孢霉3.3410原生质体和热灭活的黑曲霉SL2-111原生质体进行融合,融合温度为35℃,融合时间为10 min,融合率达到1.92%。对融合菌株进行挑选,获得了能直接利用纤维素原料的产油菌株。初步实现了选育目的。

全文目录

中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-8
目录  8-12
绪论  12-32
  第一节原生质体融合综述  12-26
    1.1 原生质体融合的技术路线  15-23
      1.1.1 直接亲本及其遗传标记的选择  15
      1.1.2 原生质体制备与再生  15-18
        1.1.2.1 原生质体的制备  15-17
        1.1.2.2 原生质体的再生  17-18
      1.1.3 原生质体融合  18-22
      1.1.4 融合体的检出  22-23
    1.2 灭活原生质体融合综述  23-26
      1.2.1 灭活原生质体融合技术的原理  24
      1.2.2 灭活原生质体融合技术的应用  24-26
    1.3 原生质体融合技术的展望  26
  第二节生物柴油综述  26-31
    2.1 生物柴油的发展状况  27-29
    2.2 生物柴油的生产方法  29-30
    2.3 微生物油脂的研究  30-31
  第三节本课题研究内容及目的意义  31-32
第一章原生质体制备和再生  32-52
  第一节材料  32-33
    1.1 菌种  32
    1.2 培养基  32
    1.3 主要药品与试剂  32-33
    1.4 主要仪器  33
  第二节方法  33-36
    2.1 亲本菌株的扩大培养  33
    2.2 亲本原生质体的制备  33-36
      2.2.1 亲本菌丝的培养  33-34
      2.2.2 亲本菌株细胞壁的酶解  34-35
      2.2.3 亲本菌株原生质体的再生  35-36
  第三节结果  36-52
    3.1 深黄被孢霉3.3410原生质体制备与再生条件实验  36-46
      3.1.1 酶系和酶浓度的选择  36-40
        3.1.1.1 单一酶液对原生质体制备的影响  36-38
        3.1.1.2 混合酶浓度对原生质体制备和再生影响  38-40
      3.1.2 菌龄的选择  40-41
      3.1.3 酶解时间的选择  41-43
      3.1.4 酶解温度的选择  43-44
      3.1.5 渗透压稳定剂的选择  44-46
    3.2 黑曲霉SL2-111原生质体制备与再生条件实验  46-52
      3.2.1 酶系和酶浓度的选择  46
      3.2.2 菌龄的选择  46-47
      3.2.3 酶解时间的选择  47-49
      3.2.4 酶解温度的选择  49-50
      3.2.5 渗透压稳定剂的选择  50-52
第二章原生质体灭活条件研究  52-60
  第一节材料  52-53
    1.1 菌种  52
    1.2 培养基  52
    1.3 主要药品与试剂  52-53
    1.4 仪器  53
  第二节方法  53-55
    2.1 原生质体紫外灭活  53-54
      2.1.1 紫外灭活的原理  53-54
      2.1.2 原生质体紫外灭活  54
      2.1.3 紫外灭活后原生质体再生  54
    2.2 原生质体热灭活  54-55
      2.2.1 热灭活的原理  54
      2.2.2 原生质体热灭活  54-55
      2.2.3 热灭活原生质体再生  55
  第三节结果  55-60
    3.1 深黄被孢霉3.3410紫外灭活条件  55-56
    3.2 深黄被孢霉33410热灭活条件  56-57
    3.3 黑曲霉SL2-111紫外灭活条件  57-58
    3.4 黑曲霉SL2-111热灭活条件  58-60
第三章原生质体融合  60-68
  第一节材料  60-61
    1.1 菌种  60
    1.2 培养基  60
    1.3 主要药品与试剂  60-61
    1.4 主要仪器  61
  第二节方法  61-62
    2.1 灭活原生质体融合与再生  61
    2.2 融合子的筛选  61-62
  第三节结果  62-68
    3.1 融合条件  62-64
      3.1.1 灭活方式的选择  62
      3.1.2 PEG浓度的选择  62-63
      3.1.3 融合时间的选择  63-64
      3.1.4 融合温度的选择  64
    3.2 融合子的筛选  64-68
      3.2.1 融合子的初筛  64-66
      3.2.2 融合子的复筛  66-68
第四章结论与讨论  68-70
  4.1 原生质体制备和再生的适宜条件  68
  4.2 原生质体灭活的适宜条件  68
  4.3 原生质体融合的适宜条件  68-69
  4.4 融合子的筛选  69-70
参考文献  70-76
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  76-78
致谢  78-80
个人简历  80-81

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