学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

三种重组七鳃鳗RGD毒素蛋白对Hela、HepG2细胞的活性影响

作　者: 张丕桥
导　师: 李庆伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 动物学
关键词: 七鳃鳗 RGD模体整合素基因重组抗肿瘤
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 30次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的:RGD毒素肽为一类含RGD模体序列的小分子量蛋白,其可凭借蛋白质一级结构上特有的RGD分子序列而成为细胞外基质（ECM）与细胞整合素（integrin）间结合的强效竞争性拮抗剂。进而通过封闭整合素的信号转导通路而起到抑制血小板聚集、抑制血管新生和抗肿瘤细胞增殖等作用。七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD1、Lj-RGD2、Lj-RGD3是分别含有1、2和3个RGD模体序列的毒性蛋白,通过对其重组蛋白的抗肿瘤活性研究,确定其重要的生物学地位及意义。方法与结果:对前期已将口腔腺目的基因片段克隆入pET23b载体的重组菌体进行蛋白表达提纯获得了分子量分别为17kD、9.6kD、15kD基因重组蛋白的高效可溶性表达。重组蛋白为融合蛋白,通过组氨酸亲和层析纯化蛋白。在已确定了其具有抗血管新生及抗血小板聚集的前期工作基础上,本课题对重组蛋白rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3抑制肿瘤细胞活性的功能进行了测定,并进行了部分作用机制研究。采用MTT法检测不同浓度rLj-RGDl、rLj-RGD2、rLj-RGD3对bFGF诱导下的Hela、HepG2细胞增殖的抑制作用,结果表明rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3能显著抑制Hela、HepG2细胞的增殖。rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3作用后的Hela、HepG2细胞经Hoechst染色及DNA ladder检测结果显示,细胞均发生调亡。rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela、HepG2细胞黏附于玻连蛋白（VN）作用的实验结果为有效抑制。采用Transwell细胞培养板对bFGF诱导下的Hela、HepG2细胞迁移实验表明,rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3能够抑制Hela、HepG2细胞的迁移。采用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela、HepG2细胞浸润实验显示,以bFGF为趋化剂的Hela、HepG2细胞穿透Matrigel的浸润行为明显受到抑制。Hela、HepG2细胞表面整合素类型检测结果表明其高表达αvβ5和β1。结论:重组日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3具有诱导Hela、HepG2细胞调亡,以剂量依赖方式抑制Hela、HepG2细胞的增殖、黏附和以bFGF为趋化剂的Hela、HepG2细胞的迁移与浸润等生物学功能,Hela、HepG2细胞表面高表达整合素αvβ₅和β1。以上研究表明,rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3具有典型的RGD毒素蛋白的功能,有望应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的生物学意义。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-9
第一章文献综述  9-18
  1.1 RGD肽与整合素识别机制研究进展  9-11
  1.2 有关Fgγ400-411序列和Aα572-575(RGDS)序列在整合素介导的细胞黏附方面的研究  11-17
  1.3 总结  17-18
第二章重组七鳃鳗RGD毒素蛋白的生物信息学分析  18-20
  2.1 数据的获得  18
    2.1.1 搜索数据  18
  2.2 分子进化分析  18
    2.2.1 构建系统发生树  18
  2.3 结果  18-19
    2.3.1 cDNA序列推导蛋白质序列的同源性分析  18-19
  2.4 讨论  19
  2.5 结论  19-20
第三章七鳃鳗RGD毒素蛋白的诱导表达/纯化与鉴定(制备rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3)  20-28
  3.1 材料  20
    3.1.1 实验材料、试剂和工具酶  20
  3.2 方法  20-23
    3.2.1 pET23b-Lj-RGD1、Lj-RGD2、Lj-RGD3转化入表达菌  20
    3.2.2 对重组表达菌的鉴定  20-21
    3.2.3 对重组菌进行不同时间与温度梯度的IPTG诱导表达  21
    3.2.4 采用包涵体及可溶性蛋白提取策略进行诱导蛋白的提取及鉴定  21
      3.2.4.1 包涵体的提取方法  21
      3.2.4.2 可溶性成分的提取方法  21
    3.2.5 Tricine-SDSPAGE鉴定  21-22
    3.2.6 重组蛋白rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3的纯化  22-23
      3.2.6.1 贮液配制:  22-23
      3.2.6.2 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3蛋白质的诱导表达  23
      3.2.6.3 可溶成份的提取  23
      3.2.6.4 上清用0.45μm的一次性除菌滤器过滤  23
      3.2.6.5 亲和层析  23
    3.2.7 采用Brodford检测法进行纯化蛋白的浓度测定  23
  3.3 结果  23-26
    3.3.1 对重组菌进行时间梯度与温度梯度的IPTG诱导表达  23
    3.3.2 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3重组蛋白的诱导表达  23-25
    3.3.3 蛋白质电泳  25
    3.3.4 rLj-RGD3蛋白纯化结果  25-26
    3.3.5 蛋白标准曲线的绘制  26
    3.3.6 纯化蛋白的浓度和产量  26
  3.4 讨论  26-27
  3.5 结论  27-28
第四章 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3的生物学活性  28-50
  4.1 材料  29
  4.2 方法  29-33
    4.2.1 细胞培养  29
    4.2.2 重组rLj-RGD3毒素蛋白的部分生物学活性测定  29-33
      4.2.2.1 细胞增殖实验  29-30
      4.2.2.2 细胞凋亡实验  30-31
        4.2.2.2.1 凋亡细胞的双苯并咪唑(Hoechst 33258,Ho)染色  30
        4.2.2.2.2 DNA ladder的测定  30-31
      4.2.2.3 Hela、HepG2细胞的粘附实验  31
      4.2.2.4 Hela、HepG2细胞的迁移实验  31-32
      4.2.2.5 Hela、HepG2细胞的侵入实验  32-33
  4.3 结果  33-47
    4.3.1 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela、HepG2细胞增殖的影响  33-34
      4.3.1.1 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela细胞增殖的抑制作用  33
      4.3.1.2 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对HepG2细胞增殖的抑制作用  33-34
    4.3.2 细胞凋亡实验  34-42
      4.3.2.1 采用Hoechst染色法对Hela、HepG2细胞核进行荧光显微镜的观察  34-40
        4.3.2.1.1 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela细胞凋亡的作用  34-37
        4.3.2.1.2 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对HepG2细胞凋亡的作用  37-40
      4.3.2.2 DNA ladder检测  40-42
    4.3.3 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela、HepG2细胞粘附的影响  42-43
    4.3.4 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela、HepG2细胞迁移的影响  43-45
      4.3.4.1 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela细胞迁移的抑制  43-44
      4.3.4.2 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对HepG2细胞迁移的抑制  44-45
    4.3.5 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela、HepG2细胞浸润的影响  45-46
      4.3.5.1 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对Hela细胞浸润的抑制  45-46
      4.3.5.2 rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3对HepG2细胞浸润的抑制  46
    4.3.6 Hela、HepG2细胞表面表达的整合素类型  46-47
  4.4 讨论  47-49
  4.5 结论  49-50
本论文的创新点  50
进一步需要研究的问题  50-51
参考文献  51-56
附录  56-58
发表论文  58-59
致谢  59-60

三种重组七鳃鳗RGD毒素蛋白对Hela、HepG2细胞的活性影响

内容摘要

全文目录

相似论文