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重组日本七鳃鳗rLj-RGD3与其五种突变体蛋白抗血管新生活性的比较

作　者: 张亚前
导　师: 王继红
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 七鳃鳗 RGD模体去整合素突变体血管新生
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Lj-RGD3为来自于七鳃鳗口腔腺的含有三个RGD模体的毒素蛋白,其除具有RGD模体这一典型RGD毒素蛋白特征外,还与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性。由于RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同,为了研究Lj-RGD3结构与功能的关系,本文对野生型Lj-RGD3进行了RGD模体缺失突变,包括:三个RGD的全缺失突变体Lj-112;仅保留第1位RGD的突变体Lj-113;仅保留第2位RGD的突变体Lj-114;仅保留第3位RGD的突变体Lj-115;将三个RGD全部突变为KGD的突变体Lj-116。本课题对上述突变体蛋白与野生型之间进行了生物学活性的比较,以确定其结构与功能的关系。具体方法为:将突变基因全序列合成后构建于pET-23b载体,对各蛋白进行IPTG诱导表达,经组氨酸亲和层析纯化。MTT结果表明,rLj-RGD3与各突变体蛋白均以剂量依赖方式抑制bFGF诱导的ECV304细胞增殖,rLj-RGD3的IC50为0.889μmol/L,rLj-112的IC50为0.160μmol/L,rLj-113的IC50为0.215μmol/L,rLj-114的IC50为0.143μmol/L,rLj-115的IC50为0.150μmol/L,rLj-116的IC50为0.529μmol/L。运用鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型结果显示,rLj-RGD3与各突变体蛋白均能抑制CAM的血管新生,且同等剂量条件下rLj-112的作用较强。采用Transwell细胞培养板检测各蛋白对bFGF诱导下细胞迁移的抑制作用,结果表明,rLj-RGD3与突变体蛋白rLj-112、rLj-113、rLj-114、rLj-115和rLj-116均能抑制ECV304细胞的迁移,抑制率分别为50%、63%、42%、65%、70%和40%。利用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-RGD3与五种突变体蛋白对ECV304细胞浸润的抑制作用,结果显示,以bFGF为趋化剂的ECV304细胞穿透Matrigel的浸润行为均明显受到抑制,且rLj-112的抑制功能较强。整合素连接激酶ILK-1的ELISA实验结果表明,rLj-RGD3与五种突变体蛋白均能下调ECV304细胞ILK-1的表达。上述结果表明,野生型rLj-RGD3与其五种不同的突变体蛋白rLj-112、rLj-113、rLj-114、rLj-115和rLj-116均具有抑制血管新生功能,且突变体Lj-112的活性相对于野生型和其他突变体蛋白较高,这说明Lj-112为HRG功能蛋白,而野生型Lj-RGD毒素蛋白与HRG序列的同源性并未使野生型抗血管新生功能得到协同加强,二者的抗血管新生功能涉及了不同的信号通路。而Lj-RGD3不同位置RGD缺失突变体的血管新生抑制功能均强于野生型的结果也表明,Lj-RGD3的三个RGD模体间的抗血管新生功能也不是协同加强的,这其中的机制应与类HRG蛋白的信号通路有关。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
第一章文献综述  11-22
  1.1 血管新生生长因子/调节因子  11-13
    1.1.1 血管内皮生长因子和受体（VEGF/VEGFR）家族  11
    1.1.2 促血管生成素（Angiopoietins, Ang）及Tie-receptors  11
    1.1.3 神经粘连因子（Neuropilins, NP）  11-12
    1.1.4 硫酸肝素糖蛋白（HSPG）  12
    1.1.5 成纤维生长因子（FGF）  12
    1.1.6 血小板生长因子（Platelet-derived growth factors, PDGF）  12-13
    1.1.7 转化生长因子-β(TGF-β)  13
    1.1.8 Ephrins 和Ephs  13
  1.2 肿瘤血管新生与内源性血管新生抑制剂  13-19
    1.2.1 肿瘤血管新生  13-14
    1.2.2 肿瘤血管的特点  14-15
    1.2.3 基底膜来源的血管新生抑制剂  15-17
    1.2.4 富含组氨酸结构域蛋白与血管新生抑制  17-19
  1.3 细胞迁移的信号传导  19-22
    1.3.1 整合素（Integrins）  19-20
    1.3.2 黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK)  20-21
    1.3.3 桩蛋白（Paxillin）  21
    1.3.4 整合素连接激酶（Integrin-linked kinase，ILK)  21-22
第二章野生型Lj-RGD3 的生物信息学分析  22-27
  2.1 数据库与软件  22
  2.2 方法  22
    2.2.1 一级结构分析  22
    2.2.2 二级结构预测  22
    2.2.3 同源序列比对  22
  2.3 结果  22-26
    2.3.1 野生型Lj-RGD3 一级结构分析  22-23
    2.3.2 野生型Lj-RGD3 信号肽分析及其二级结构  23-24
    2.3.3 野生型Lj-RGD3 同源性比对结果  24-26
  2.4 结论  26-27
第三章野生型rLj-RGD3 及其突变体rLj-113、rLj-114、rLj-115、rLj-116 的基因合成与蛋白的诱导表达、纯化及鉴定  27-39
  3.1 材料、试剂  27
  3.2 方法  27-31
    3.2.1 合成目的基因片段  27
    3.2.2 目的基因质粒的提取  27-28
    3.2.3 琼脂糖凝胶电泳[74]  28
    3.2.4 重组质粒转化至E.coli BL21 表达菌中[74]  28-29
    3.2.5 对突变体菌进行不同时间和温度梯度的IPTG 诱导  29
    3.2.6 五种突变体蛋白的表达及提纯  29-30
    3.2.7 Tricine-SDS PAGE[75]电泳  30-31
    3.2.8 采用考马斯亮蓝G-250 法对纯化的蛋白浓度进行测定  31
  3.3 结果  31-38
    3.3.1 野生型 Lj-RGD3 的蛋白序列比对分析,突变体 Lj-112、Lj-113、Lj-114、Lj-115 以及 Lj-116 的 cDNA 序列合成及其推导的氨基酸序列  31-34
    3.3.2 目的基因质粒的提取及表达菌的转化  34
    3.3.3 对Lj-RGD3 及其突变体表达菌进行不同时间和温度梯度的IPTG 诱导表达  34-37
    3.3.4 基因重组蛋白 rLj-RGD3、rLj-112、rLj-113、rLj-114、rLj-115 以及 rLj-116 的纯化及鉴定  37
    3.3.5 蛋白标准曲线的绘制及蛋白质浓度的测定  37-38
  3.4 讨论  38
  3.5 结论  38-39
第四章野生型 rLj-RGD3 及其突变体 rLj-112 、rLj-113、rLj-114、 rLj-115、 rLj-116 抗血管新生的活性及部分机制的研究  39-52
  4.1 材料、试剂  39
  4.2 方法  39-43
    4.2.1 细胞培养  39
    4.2.2 细胞增殖实验  39-40
    4.2.3 人整合素酶联免疫分析  40-41
    4.2.4 ECV304 细胞的迁移实验  41
    4.2.5 ECV304 细胞的浸润实验  41-42
    4.2.6 rLj-RGD3 及其五种突变体蛋白对血管新生的抑制作用  42-43
  4.3 结果  43-50
    4.3.1 对bFGF 诱导的ECV304 细胞增殖的抑制作用  43-45
    4.3.2 对bFGF 诱导的鸡绒毛尿囊膜（CAM）血管新生的抑制作用  45-46
    4.3.3 ECV304 细胞的迁移实验  46-48
    4.3.4 ECV304 细胞的浸润实验  48
    4.3.5 ELISA 法测定野生型 rLj-RGD3 及突变体 rLj-112、rLj-113、rLj-114、rLj-115、 rLj-116 对整合素连接激酶(ILK-1)表达的影响  48-50
  4.4 讨论  50-52
5 结论  52-53
本论文的创新点  53
进一步需要研究的问题  53-54
参考文献  54-61
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  61-62
附录  62-68
致谢  68

重组日本七鳃鳗rLj-RGD3与其五种突变体蛋白抗血管新生活性的比较

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