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邻苯二甲酸二丁酯的生物降解以及土壤中关键细菌群落动态解析

作　者: 代沁芸
导　师: 吴学玲；杨宇
学　校: 中南大学
专　业: 微生物学
关键词: DBP 生物降解邻苯二甲酸3,4双加氧酶生物强化 PCR-DGGE
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

邻苯二甲酸酯是一类环境内分泌干扰物。它具有环境激素作用,可在极低的浓度下干扰人类和动物的内分泌系统,目前已被多个国家列为优先控制的污染物。近年来,由于DBP的广泛应用,土壤、河流、湖泊、海洋底质、饮用水、垃圾场,甚至食品中都检测到了DBP的存在,对人类的身体健康造成了严重的威胁。DBP在环境中的水解、光解速度非常缓慢,属于难降解物质。微生物降解被认为是自然环境中DBP完全矿化的主要过程,大量降解菌从各类环境中分离得到。本研究从全国四个不同地点的河流或池塘底泥样品中各筛选到一株以DBP为唯一碳源和能源的细菌。根据形态学观察,生理生化指标测试,分子生物学鉴定,这四株DBP降解菌(JDC2、JDC13、JDC26、JDC33)初步鉴定为Gordonia属。同时,利用一对简并引物在这四株菌中成功扩增出编码邻苯二甲酸3,4双加氧酶的基因片段,这也是首次在Gordonia中成功扩增出邻苯二甲酸3,4双加氧酶的基因片段。通过序列比对结果显示Gordonia中该基因序列具有高度的同源性,而与其它属的细菌的邻苯二甲酸3,4双加氧酶基因相比具有一定的差异。因此该基因序列具有属特异性。以DBP作为降解对象,利用高校液相色谱测试了四株菌对DBP的最佳降解条件,结果显示JDC2、JDC13、JDC26、JDC33降解DBP的最适条件均为：温度30℃,pH 7.0,转速175-250r/min。在最适条件下进行了DBP降解能力的研究和降解动力学分析。结果显示四株菌中JDC2的降解速度最快,在18h内降解了400 mg/L DBP中的96%。JDC13和JDC26分别在30h和48h内降解了98%以上。而JDC33的降解速度较慢,在48h内降解了78%。动力学分析表明四株菌对DBP的降解曲线能够很好的符合一级动力学方程,其半衰期分别为JDC29.24h、JDC139.89h、JDC2627.61h、JDC3331.12h。同时对这四株菌的底物广谱性行进行了测试,结果显示侧链较短的邻苯二甲酸酯比侧链较长的邻苯二甲酸酯更容易被降解菌利用。而这四株菌中JDC2和JDC13能更好的利用侧链较长的邻苯二甲酸酯。生物强化是接种具有特定降解能力的微生物来增强环境中的生物活性,以达到修复污染环境的目的。本文以加入DBP的土壤为研究对象,考察了利用DBP高效降解菌JDC13进行生物强化修复的效果,对DBP在土壤中的降解情况和土壤中细菌总数的动态变化,研究结果显示接种外源降解菌JDC13有利于土壤中DBP的降解,与直接用土壤中的土著微生物降解DBP相比,其完全降解的时间提前了5天。土壤中加入DBP在最初的一段时间内会抑制土著微生物的生长,接种外源降解菌可以有效减少这种不利影响。因此,接种JDC13对DBP污染土壤进行生物强化修复具有很好的效果。本研究利用现代分子生物学手段——PCR-DGGE对生物强化过程中土壤细菌群落结构的变化进行监测,为生物强化技术的实际应用提供了有参考价值的信息。PCR-DGGE分析结果表明,只加入DBP与同时加入DBP和外源降解菌JDC13都会显著影响土壤中细菌群落构成,且二者细菌群落变化也有明显的差异。由于DBP对土壤中能够耐受和降解DBP细菌的富集作种用,JDC13以及放线菌、p变形菌等在DBP土壤降解过程中成为优势种群,其中大部分优势细菌测序结果与已报道PAEs降解菌序列相似。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
第一章文献综述  10-22
  1.1 邻苯二甲酸酯类化合物的概述  10-15
    1.1.1 邻苯二甲酸酯的结构和理化性质  10-12
    1.1.2 邻苯二甲酸酯的污染现状  12-14
    1.1.3 邻苯二甲酸酯类环境荷尔蒙的危害  14-15
  1.2 邻苯二甲酸酯类化合物的生物降解研究  15-19
    1.2.1 环境中邻苯二甲酸酯污染物降解研究  15-16
    1.2.2 邻苯二甲酸酯的生物降解  16-17
    1.2.3 邻苯二甲酸酯的生物降解途径研究  17-19
  1.3 DBP污染土壤的生物修复以及细菌群落研究  19-21
    1.3.1 DBP污染土壤的生物修复  19
    1.3.2 微生物群落结构研究方法  19-21
  1.4 本研究的目的与意义  21-22
第二章邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离鉴定  22-30
  2.1 前言  22
  2.2 材料方法  22-25
    2.2.1 样品来源  22
    2.2.2 主要试剂和培养基  22
    2.2.3 菌株的富集、分离与纯化  22-23
    2.2.4 细菌生理生化特性测定  23
    2.2.5 16S rRNA的扩增、测序和系统发育树的构建  23-24
    2.2.6 邻苯二甲酸双加氧酶基因的PCR扩增和测序  24-25
  2.3 结果与讨论  25-28
    2.3.1 菌株的分离及生理生化特征  25-26
    2.3.2 16S rDNA的扩增和系统发育树的构建  26-27
    2.3.3 邻苯二甲酸双加氧酶基因的克隆及序列同源性分析  27-28
  2.4 本章小结  28-30
第三章邻苯二甲酸二丁酯的生物降解及动力学分析  30-38
  3.1 前言  30
  3.2 材料与方法  30-31
    3.2.1 主要试剂、仪器和培养基  30
    3.2.2 DBP生物降解条件研究  30-31
    3.2.3 最适条件下DBP的生物降解  31
    3.2.4 底物广谱性试验  31
    3.2.5 分析方法  31
  3.3 结果  31-36
    3.3.1 DBP标准曲线的建立  31-32
    3.3.2 初始pH对DBP降解的影响  32-33
    3.3.3 温度对DBP降解的影响  33
    3.3.4 转速对DBP降解的影响  33-34
    3.3.5 最适条件下四株菌的DBP降解能力  34-35
    3.3.6 四株菌的DBP降解动力学分析  35-36
    3.3.7 底物广谱性分析  36
  3.4 讨论  36-37
  3.5 本章小结  37-38
第四章土壤中邻苯二甲酸二丁酯的降解及细菌群落变化  38-48
  4.1 前言  38
  4.2 材料与方法  38-40
    4.2.1 样品来源  38
    4.2.2 降解菌的准备  38-39
    4.2.3 土壤中DBP的降解  39
    4.2.4 土壤中细菌总数的测定  39
    4.2.5 土壤中细菌群落结构的PCR-DGGE分析  39-40
  4.3 结果  40-45
    4.3.1 土壤中DBP的降解和动力学分析  40-41
    4.3.2 土壤中细菌总数的动态变化  41-42
    4.3.3 土壤中细菌群落结构分析  42-45
  4.4 讨论  45-47
  4.5 本章小结  47-48
第五章结论  48-50
参考文献  50-57
研究成果  57-58
致谢  58

邻苯二甲酸二丁酯的生物降解以及土壤中关键细菌群落动态解析

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