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三个意蜂种群MRJP1基因多态、基因表达和含量的相关性分析

作　者: 刘敏
导　师: 陈国宏；吉挺
学　校: 扬州大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 意大利蜜蜂 MRJP1 单核甘酸多态性荧光定量PCR 高效液相色谱
分类号: S892
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蜂王浆中的主要王浆蛋白是王浆蛋白中的水溶性部分,占总蛋白含量的46%-89%,为主要成分。研究表明,MRJPs是由同源性很高的一系列蛋白组成的蛋白家族,这一家族共有九个成员。大量实验证明,蜂王浆具有重要的医疗保健作用和生物学功能,这可能与王浆中的MRJPs密切相关。本研究选取平湖浆蜂、美意、苏王1号3个王浆性能不同的意蜂种群为研究对象,首次利用高效液相色谱技术测定三个种群MRJP1的相对含量,分析不同种群间的差异规律,探讨MRJP1作为评价蜂王浆新鲜度的指标的可行性;首次利用荧光定量PCR技术检测MRJP1基因在不同种群间的表达规律;用PCR-SSCP方法检测MRJP1基因的多态性,揭示不同基因型在种群间的分布规律以及与MRJP1含量性状的关联,为今后选育出MRJP1高含量性状的蜜蜂良种奠定基础。主要研究结果如下:1.利用HPLC技术对3个种群MRJP1的相对含量进行测定,结果表明:平湖浆蜂蜂王浆中MRJP1的相对含量为0.25%,与苏王1号有显著差异(P<0.05),与美意有极显著差异(P<0.01),但苏王1号和美意之间无显著差异。三种群所在产地同属于长江三角洲地区,其气候、环境等地理概况基本一致,并且在同一时期、相同的蜜源(油菜)条件下采集的样本。王浆产量的高低可能影响到蜂王浆MRJP1含量的高低,而MRJP1的含量和不同的蜂种之间也有一定的联系,不能将MRJP1作为评价蜂王浆新鲜度的指标。2.选用同一时期、相同的蜜源(油菜)、同一地区、相同日龄(10日龄)的3个意蜂种群为研究对象,采用荧光定量PCR技术检测MRJP1基因在3个种群间的表达差异,结果表明苏意MRJP1基因的相对表达量显著高于平湖浆蜂和美意(P<0.05),而平湖浆蜂和美意之间无显著差异,说明蜂王浆产量高低与蜂群中工蜂个体分泌MRJP1的能力没有必然联系。MRJP1含量与其mRNA的的表达量相关性分析结果表明其相关系数为0.085,无显著相关。3.根据GenBank中西方蜜蜂(A.mellifera)MRJP1的DNA序列设计引物,采用PCR-SSCP技术对3个种群进行MRJP1基因多态性分析,共检测到3对引物有多态位点。其中,H5引物检测到2个单核苷酸变异位点,有三种基因型,均以B基因为优势基因,且B等位基因频率分别为0.766、0.55、0.833;W6引物检测到4个单核苷酸变异位点,有二种基因型,均以D基因为优势基因,且D等位基因频率分别为0.867、0.967、0.900;H6引物检测到8个单核苷酸变异位点,有三种基因型,均以E基因为优势基因,其中E等位基因频率分别为0.717、0.667、0.717。4. H5引物中由于碱基突变所产生的不同基因型在3个种群中的分布存在着差异,不同基因型的MRJP1含量也存在不同,且AB基因型中样本的MRJP1含量较大,与AA和BB基因型有显著的差异。而其它基因型在品系间和MRJP1含量中均无显著差异。因此,AB基因型可能是与MRJP1含量有正相关的有利基因型,可能作为今后筛选蜂王浆MRJP1高含量种群的一个候选基因型。

全文目录

中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-14
第一章文献综述  14-31
  1. 蜂王浆及其新鲜度指标  14-18
    1.1 蜂王浆的作用  14-15
    1.2 蜂王浆的组成  15
    1.3 蜂王浆新鲜度指标的研究进展  15-18
      1.3.1 王浆酸  15-16
      1.3.2 王浆肌动蛋白  16-17
      1.3.3 超氧化物歧化酶活力(SOD)  17
      1.3.4 葡萄糖氧化酶（GOD）  17
      1.3.5 水溶性蛋白  17-18
  2. 王浆主要蛋白的研究进展  18-21
    2.1 MRJPs 的序列研究进展  19-20
    2.2 MRJP1 的研究进展  20-21
  3. 高效液相色谱法概述  21-24
    3.1 基本原理  21
    3.2 装置  21-24
      3.2.1 色谱柱  22
      3.2.2 高压输液泵  22-23
      3.2.3 检测器  23-24
    3.3 高效液相色谱法在蜂王浆检测中的应用  24
  4. 实时荧光定量PCR 分析技术  24-27
    4.1 荧光定量PCR 技术的原理  24
    4.2 荧光定量PCR 技术的种类  24-26
      4.2.1 非特异性 DNA 结合染料法  25
      4.2.2 探针法  25-26
    4.3 定量方法  26-27
    4.4 荧光定量PCR 技术在蜜蜂研究中的应用  27
  5. 单核苷酸多态性（SNP）及研究方法  27-29
    5.1 单核苷酸多态性  27-28
    5.2 SNP 的研究方法：PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）  28-29
  6. 本研究的目的与意义  29-31
第二章不同意蜂种群间蜂王浆中 MRJP1 相对含量的比较  31-38
  1. 材料  31
    1.1 样本  31
    1.2 仪器  31
    1.3 试剂  31
  2. 方法  31-33
    2.1 蜂王浆水溶性蛋白的提取  31-32
    2.2 水溶性蛋白浓度的测定  32
    2.3 色谱条件  32-33
    2.4 样品前处理和测定  33
    2.5 数据处理  33
  3. 结果与分析  33-35
    3.1 蜂王浆中水溶性蛋白的浓度测定结果  33
    3.2 HPLC 结果分析  33-35
  4. 讨论  35-38
    4.1 实验样本的选择  35
    4.2 高效液相色谱技术的应用  35-36
      4.2.1 GPC-RI-MALLS 技术的优点  35-36
      4.2.2 流动相的选择  36
      4.2.3 样品的处理  36
    4.3 不同种群间MRJP1 相对含量的差异分析  36-37
    4.4 MRJP1 作为评价蜂王浆新鲜度指标的可行性分析  37-38
第三章不同意蜂种群间 MRJP1 基因表达的比较  38-55
  1 材料与方法  38-47
    1.1 试验材料  38-39
      1.1.1 试验材料  38
      1.1.2 主要试剂与仪器  38
      1.1.3 主要试剂的配制  38-39
    1.2 试验方法  39-45
      1.2.1 蜜蜂头部总RNA 提取  39-41
      1.2.2 反转录  41
      1.2.3 引物设计  41
      1.2.4 目的片段扩增  41-42
      1.2.5 DNA 片段的克隆测序  42-44
      1.2.6 扩增效率的鉴定  44-45
      1.2.7 实时荧光定量 PCR  45
    1.3 统计分析  45-47
      1.3.1 荧光定量计算方法  45-46
      1.3.2 引物扩增效率的计算  46-47
  2 结果与分析  47-52
    2.1 总 RNA 的检测  47
    2.2 PCR 扩增目的片断  47-48
    2.3 测序结果分析  48
    2.4 标准曲线分析  48-50
    2.5 溶解曲线分析  50-51
    2.6 3 个蜜蜂种群 mRNA 的表达结果比较  51-52
    2.7 MRJP1 基因表达和蛋白含量的相关性  52
  3 讨论  52-55
    3.1 Real-Time PCR 技术的应用  52-53
      3.1.1 Real-Time PCR 技术的优点  52
      3.1.2 本研究的定量方法  52
      3.1.3 SYBR GreenⅠ荧光染料的评价  52-53
      3.1.4 标准曲线和溶解曲线的分析  53
    3.2 不同蜂种间MRJP1 基因表达的差异分析  53-54
    3.3 MRJP1 基因表达与蛋白含量的相关性分析  54-55
第四章三个意蜂种群 MRJP1 基因的多态性分析  55-70
  1 材料与方法  55-60
    1.1 试验材料  55-56
      1.1.1 试验材料  55
      1.1.2 主要仪器  55
      1.1.3 主要试剂的配制  55-56
      1.1.4 主要分子生物学软件  56
    1.2 试验方法  56-59
      1.2.1 基因组DNA 提取  56-57
      1.2.2 引物设计与合成  57-58
      1.2.3 PCR 扩增  58
      1.2.4 琼脂糖检测  58
      1.2.5 SSCP 分析  58-59
      1.2.6 硝酸银染色  59
      1.2.7 多态片段的序列测定  59
    1.3 统计分析方法  59-60
  2 结果与分析  60-68
    2.1 SNPs 多态性检测  60-64
      2.1.1 SSCP 电泳结果分析  60-61
      2.1.2 测序结果分析  61-64
    2.2 3 个意蜂种群MRJP1 基因多态位点的基因型和基因频率分析  64-66
    2.3 MRJP1 基因不同多态位点的杂合度和多态信息含量分析  66-67
    2.4 不同基因型与MRJP1 含量的关联  67-68
  3 讨论  68-70
    3.1 基因多态性分析  68
    3.2 群体遗传学分析  68-69
    3.3 不同基因型与MRJP1 含量的关联分析  69-70
全文结论  70-71
参考文献  71-79
致谢  79-80
攻读学位期间发表学术论文目录  80

三个意蜂种群MRJP1基因多态、基因表达和含量的相关性分析

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