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罗非鱼腐败过程菌群结构分析及腐败菌的分离、鉴定与调控

作　者: 韩少锋
导　师: 周志刚
学　校: 中国农业科学院
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 罗非鱼细菌菌群结构变性梯度凝胶电泳技术(DGGE) 腐败菌 N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)
分类号: S983
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

罗非鱼是中国最重要的养殖和出口鱼类,但由于罗非鱼及相关产品货架期短,因此影响了罗非鱼养殖业的进一步发展。由于微生物在鱼类腐败过程中起主导作用,因此分析鱼类腐败过程中菌群结构变化及腐败菌群间的群体感应,有助于我们研究延长水产鱼类保藏时间、减少经济损失的方法。本研究中以新鲜罗非鱼为试验对象,分别设置剔除鱼骨和肠道(JY)和只剔除鱼骨(QY)(每组有3个重复)两组试验样品,并分别在4℃和25℃贮存;以相同的时间(1、3、7和14天)取样并检测样品中的菌群变化。应用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)、平板计数、pH的测定以及腐败菌的分离鉴定等方法对腐败过程中的菌群变化进行分析。应用DGGE技术分析表明JY样品腐败过程中的细菌属于α-变形杆菌亚门(α-proteobacteria)、β-变形杆菌亚门(β-proteobacteria)、γ-变形杆菌亚门(γ-proteobacteria)、厚壁门(Firmicutes)和未分类菌(Unclassified);其中γ-变形杆菌门细菌是样品腐败过程中的主要优势菌。QY样品腐败过程中的细菌属于变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁门(Firmicutes)和未分类菌(Unclassified);其中变形杆菌门细菌是样品腐败过程中的主要优势菌。有研究表明DGGE技术只能检测到样品中高于总菌量1%的优势菌群,但是鱼肉中部分低丰度的致病菌仍能引起食品安全风险,因此用传统纯培养方法对样品中的细菌进行分离鉴定是对DGGE的有益补充。本研究采用在25℃储存3天的样品对可培养细菌进行分离鉴定,共获得23株细菌。其分别属于放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁门(Firmicutes)和变形杆菌亚门(Proteobacteria)。目前已有研究表明群体感应的N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)能够调控多种革兰氏阴性致病菌的基因的表达。本研究应用一种来源于芽孢杆菌的高丝氨酸内酯酶(AiiAB546)降解AHLs,进一步分析群体感应信号分子和腐败相关的酶基因表达的关系。由于摩氏摩根菌(M. morganii)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、黄杆菌(Flavobacteriacea)在样品的腐败过程中起关键作用,并且都能够产生AHLs,因此本研究中以这三株菌为实验菌株,研究高丝氨酸内酯酶对胞外蛋白酶和组氨酸脱羧酶的调控作用。试验结果表明AiiA B546对黄杆菌所产的信号分子有降解作用且能降低其胞外蛋白酶酶活,但是对摩氏摩根菌、普通变形杆菌所产信号分子没有作用。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-18
  1.1 鱼类的腐败  12-15
    1.1.1 肉类腐败菌的种类及特性  13
    1.1.2 鱼类相关腐败菌  13-14
    1.1.3 组胺产生菌  14
    1.1.4 腐败菌的特性和调节  14-15
  1.2 DGGE 在水产微生物研究中的应用  15-18
    1.2.1 DGGE 原理  16-17
    1.2.2 DGGE 技术局限性  17-18
第二章罗非鱼腐败过程菌群结构分析  18-35
  2.1 试验材料  18
  2.2 试验方法  18-22
    2.2.1 鱼肉腐败样中细菌基因组DNA 的提取和纯化  18
    2.2.2 基因组DNA 浓度和纯度的检测  18-19
    2.2.3 16S rRNA 基因V3 高可变区的PCR 扩增  19
    2.2.4 变性梯度胶的制备  19-22
  2.3 数据处理  22
  2.4 结果与分析  22-33
    2.4.1 鱼肉腐败样品中细菌基因组DNA 的提取和纯化  22
    2.4.2 JY 样品DGGE 图谱分析  22-28
    2.4.3 QY 样品DGGE 图谱分析  28-33
  2.5 讨论  33-34
  本章小结  34-35
第三章腐败菌的计数、分离和初步鉴定  35-45
  3.1 试验材料  35
  3.2 试验方法  35-37
    3.2.1 PCA 平板计数  35
    3.2.2 样品pH 值的测定  35
    3.2.3 腐败菌的分离和16S rRNA 基因的初步鉴定  35-37
  3.3 数据处理  37
  3.4 结果与分析  37-43
    3.4.1 JY 和QY 在不同贮存温度下pH 的变化  37-38
    3.4.2 JY 样品计数结果  38
    3.4.3 QY 样品计数结果  38-39
    3.4.4 菌株分离与鉴定  39-43
  3.5 讨论  43-44
  本章小结  44-45
第四章腐败菌的调控  45-56
  4.1 试验材料  45
    4.1.1 菌种  45
    4.1.2 培养基  45
    4.1.3 试剂  45
  4.2 试验方法  45-50
    4.2.1 组胺产生菌的筛选  45-47
    4.2.2 胞外蛋白酶产生菌的筛选及酶活测定  47-48
    4.2.3 群体感应信号分子活性检测  48-49
    4.2.4 AiiA_(B546) 对腐败菌的调节  49-50
    4.2.5 Tn-5 复合体插入突变试验  50
  4.3 结果与分析  50-54
    4.3.1 组氨酸脱羧酶产生菌的筛选  50
    4.3.2 蛋白酶产生菌的筛选  50
    4.3.3 群体感应信号分子活性检测结果  50-51
    4.3.4 AiiA_(B546) 对信号分子的降解  51-52
    4.3.5 蛋白酶的酶活测定  52
    4.3.6 AiiA_(B546) 对J2 菌株蛋白酶表达的调控  52
    4.3.7 AiiA_(B546) 防腐试验分析  52-54
  4.4 讨论  54-55
  本章小结  55-56
第五章结论与不足  56-58
  5.1 全文结论  56-57
    5.1.1 本文研究的目的、意义及创新点  56
    5.1.2 罗非鱼腐败过程中细菌菌落的动态分析  56
    5.1.3 腐败菌分离纯化和初步鉴定  56-57
    5.1.4 腐败菌的调控  57
  5.2 不足  57-58
    5.2.1 未完成群体感应系统突变试验  57
    5.2.2 PCR-DGGE 技术研究罗非鱼腐败的不足  57-58
参考文献  58-67
致谢  67-68
作者简历  68

罗非鱼腐败过程菌群结构分析及腐败菌的分离、鉴定与调控

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