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罗非鱼不同群体遗传变异的微卫星标记分析

作　者: 曹祥
导　师: 杨弘
学　校: 南京农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 罗非鱼引种微卫星选育强度遗传多样性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究采集了来自淡水渔业研究中心的尼罗罗非鱼埃及品系、88品系和奥利亚罗非鱼,与来自广西水产所的尼罗罗非鱼、美国品系和奥利亚罗非鱼共174个样品的血样,采用酚／氯仿法提取基因组DNA,利用微卫星标记技术,分析了6个群体在25个微卫星基因座的遗传多样性,探讨了各群体内的遗传变异和各群体间的遗传关系,计算了等位基因频率、群体杂合度(功、有效等位基因数、多态信息含量、群体间的Nei’s标准遗传距离(Ds)和DA遗传距离等,并利用Ds遗传距离分别构建了6个罗非鱼群体的系统聚类图。研究结果如下：1.利用所选的25个微卫星基因座对6个罗非鱼群体的174个个体进行PCR扩增,得到特异性的扩增产物。共检测到143个等位基因,平均每个基因座5.72个等位基因,最多为8个,最少为3个；有效等位基因数目总共为66.91,有效等位基因数小于实际观察等位基因数,这是等位基因分布不均匀的结果。同时进行优势等位基因分析,结果表明：25个微卫星基因座都有优势等位基因存在。2. Hardy-Weinberg平衡检验结果表明：用基于马可夫链模型的Hardy-Weinberg精确P值的无偏估测对各群体的多基因座检测发现,6个罗非鱼群体都处于遗传平衡状态；而对各基因座进行的多群体检测发现,有4个基因座出现了显著的遗传不平衡性；单群体单基因座检测发现,6个群体中有8.11%的基因座处于遗传不平衡状态。究其原因有随机交配发生偏移、遗传漂变及选择等因素,其中选择所造成的影响最大,其次为随机交配发生的偏移以及遗传漂变。3.根据统计结果可知：25个微卫星基因座大部分为高度多态性基因座,平均多态信息含量在0.404-0.6735之间,6个罗非鱼群体具有的遗传多样性适中,各个群体的平均PIC值在0.4212～0.6105,尼罗罗非鱼美国品系的PIC最高为0.6105,PIC最低的为中心奥利亚罗非鱼群体。6个群体观察杂合度变化范围在0.7253～0.8160之间,期望杂合度变化范围在0.5146～0.6834之间,杂合度较高,其中杂合度最高的是广西尼罗群体,中心奥利亚群体则为最低。4.用PopGene 1.32软件软件分别计算了6个罗非鱼群体之间的Nei’s标准遗传距离和DA遗传距离,并用MEGA3软件对其进行聚类,结果表明：由Nei’s标准遗传距离用邻近结合法(NJ法)聚类所得的结果与各群体之间的历史起源、选育方式、人工选择强度等特征基本吻合。用Ds遗传距离将6个群体分为两类：Ⅰ类：尼罗罗非鱼埃及品系、尼罗广西群体、尼罗罗非鱼美国品系和尼罗罗非鱼88品系聚为一类。在这四个群体中尼罗罗非鱼埃及品系首先与尼罗广西群体聚到一起,然后又和尼罗罗非鱼美国品系相聚,最后尼罗罗非鱼88品系与它们聚在一起。Ⅱ类：中心奥利亚罗非鱼群体和广西奥利亚罗非鱼群体聚为一类。5.F-统计量分析表明：微卫星基因座的杂合性基因多样性的比率(FST)的变化范围是从基因座UNH738的0.0779到基因座UNH183的0.3484,平均值为0.1937；基因流(Nm)在0.4675(基因座UNH183)和1.8425(基因座UNH189)之间变动,平均值为1.0407。6.尼罗罗非鱼埃及品系和尼罗广西群体间的标准遗传距离和分化指数分别为0.1913、0.0904,两个奥利亚群体之间的标准遗传距离和分化指数分别为0.0911、0.0599。通过分子方差分析,奥利亚罗非鱼变异来源群体间所占的比例为6.82%,而尼罗罗非鱼变异来源群体间所占的比例为13.08%。表明淡水渔业研究中心选育的“夏奥1号”奥利亚罗非鱼适合其他地方养殖,尼罗罗非鱼的选育还需要考虑各个养殖区域的情况进一步提纯。本文的聚类结果与群体的历史起源、选育方式、人工选择强度等特征基本吻合。说明了Ds和DA这两种估算遗传距离的方法结合微卫星标记构建系统发生树是可行的。本研究的结果可为正确评估各群体遗传多样性的资源价值、制定合理可行的保种和选育方案提供理论依据。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一章文献综述 11-35 1 鱼类遗传多样性的研究意义 11-13 1.1 遗传多样性的定义 11-12 1.2 鱼类遗传多样性研究的意义 12-13 2 鱼类遗传多样性的研究方法 13-17 2.1 传统方法 14-15 2.2 DNA分子标记 15-17 2.2.1 显性遗传标记 15-16 2.2.2 共显性遗传标记 16-17 3 微卫星(SSR)技术及其在鱼类遗传育种中的应用 17-23 3.1 微卫星DNA概念 17 3.2 微卫星DNA在基因组上产生的机制及功能 17-18 3.3 微卫星分子标记的优点 18-20 3.3.1 丰富的多态信息含量 18-19 3.3.2 引物的通用性 19 3.3.3 分析操作简单 19 3.3.4 共显性特点 19-20 3.3.5 使用样品量少 20 3.4 微卫星分子标记的局限性 20-21 3.4.1 无效等位基因(null allele)的存在 20 3.4.2 "异源同形"现象的存在 20 3.4.3 微卫星突变的偏向性 20-21 3.5 微卫星标记在鱼类遗传育种上应用 21-23 3.5.1 群体的多样性研究 21 3.5.2 家养群体与野生群体遗传判别 21 3.5.3 种群亲缘关系研究 21-22 3.5.4 家系分析 22 3.5.5 进化研究 22-23 3.5.6 发育研究 23 3.5.7 管理和保护濒临灭亡群体 23 4 罗非鱼概况 23-32 4.1 罗非鱼的分类地位和分布 23-24 4.2 我国罗非鱼引种概况 24-25 4.3 我国罗非鱼养殖现状及主要品种 25-28 4.3.1 我国罗非鱼养殖现状 25-27 4.3.2 我国主要罗非鱼养殖品种 27-28 4.4 我国罗非鱼养殖中存在问题 28-29 4.4.1 不耐低温 28 4.4.2 繁殖过快 28 4.4.3 种质易混杂 28 4.4.4 雄性率达不到100% 28-29 4.5 罗非鱼遗传多样研究进展 29-32 本试验的意义与目的 32-35第二章罗非鱼不同群体遗传变异的微卫星标记分析 35-69 1 前言 35-36 2 实验材料 36-37 2.1 材料 36 2.2 实验试剂及仪器设备 36-37 3 实验步骤 37-46 3.1 罗非鱼采血方法 37 3.1.1 本方法所用化学试剂及材料 37 3.1.2 尾部静脉采血的具体步骤 37 3.2 基因组DNA的提取及检测 37-40 3.2.1 本方法所用化学试剂与实验仪器 37-38 3.2.2 本方法中溶液的配置 38 3.2.3 基因组DNA提取的具体步骤 38-39 3.2.4 基因组DNA的检测(琼脂糖凝胶电泳检测) 39-40 3.3 引物的设计与筛选 40 3.3.1 所用试剂与实验仪器 40 3.3.2 引物设计与筛选 40 3.4 微卫星群体分析 40-44 3.4.1 本方法所用化学试剂 40-42 3.4.2 本方法所用仪器设备 42 3.4.3 PCR反应体系及程序 42-43 3.4.4 PCR扩增结果检测 43-44 3.5 数据分析 44-46 3.5.1 统计方法 44-46 3.5.2 统计分析 46 4 结果 46-62 4.1 罗非鱼基因组DNA的提取 46-47 4.1.1 琼脂糖凝胶电泳结果 46-47 4.1.2 紫外分光光度法检测 47 4.2 微卫星位点的筛选和扩增结果 47-50 4.3 等位基因和基因频率(见附件中表2-2) 50-52 4.4 群体遗传多样性分析 52-57 4.4.1 六个群体的多态信息含量 52-53 4.4.2 六个群体的杂合度分析 53-55 4.4.3 六个群体的等位基因数和有效等位基因 55-56 4.4.4 六个罗非鱼群体的群体结构检测 56-57 4.5 群体间遗传变异 57-62 4.5.1 遗传距离 57-59 4.5.2 聚类分析 59-60 4.5.3 群体间遗传分化 60-62 5 讨论 62-69 5.1 检测数据的有效性 62-63 5.2 罗非鱼群体的遗传多样性 63-65 5.3 源群体与引种两个群体遗传变异 65 5.4 群体间亲缘关系与遗传分化 65-69全文总结 69-71参考文献 71-77附录 77-81致谢 81-83攻读学位期间待发表论文及参与研究的课题 83

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