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鱼类胶原蛋白的分离纯化及其过敏原性研究

作　者: 潘冰青
导　师: 苏文金；刘光明
学　校: 集美大学
专　业: 食品科学
关键词: 罗非鱼鲤鱼胶原蛋白亚基稳定性 IgE结合活性过敏性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起,表现为哮喘、荨麻疹、皮肤瘙痒等症状,严重时会引起过敏性休克甚至危及生命。在引发过敏的食物中,水产品是非常重要的一类。已有的研究表明,原肌球蛋白和精氨酸激酶为甲壳类过敏原,小清蛋白为鱼类过敏原。近年来有报道称胶原蛋白可能为鱼类的新型过敏原。罗非鱼(Tilapia zillii)和鲤鱼(Cyprinus carpio carpio)为国内最常见的鱼类,其肉质鲜美、营养丰富,深受广大消费者的喜爱。本文以这两种鱼类为实验对象,主要进行了胶原蛋白的分离纯化、抗体制备、稳定性和IgE结合活性比较、过敏性分析等研究。首先采用碱溶、酸溶、NaCl盐析等方法,从罗非鱼和鲤鱼的鱼皮中分离纯化得到了胶原蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,两种胶原蛋白均由α1(120 kDa)、α2(115 kDa)、β(250 kDa)、γ亚基等组成。双向电泳结果显示,罗非鱼胶原蛋白的pI约为9.0,并确认了其α1、α2、β亚基的分子量及纯度。以纯化的罗非鱼胶原蛋白免疫新西兰大白兔,制备了兔抗罗非鱼胶原蛋白的多克隆抗体。通过不同温度加热、不同pH缓冲液、模拟胃液消化等方法处理,进行了纯化胶原蛋白与鲢鱼小清蛋白的稳定性比较。SDS-PAGE结果显示,胶原蛋白的热稳定性不如小清蛋白,pH稳定性两者相似,胶原蛋白比小清蛋白更耐胃蛋白酶消化。通过罗非鱼胶原蛋白加热处理后样品的模拟胃液消化实验,表明0℃与50℃加热处理对于胶原蛋白的胃蛋白酶消化没有明显影响。罗非鱼胶原蛋白的二相消化实验表明,胶原蛋白模拟胃液消化产物分子量在120 kDa以下,继续进行模拟肠液消化后,消化产物分子量下降至80 kDa以下。通过carboxymethyl-cellulose预装柱(5 mL)的离子交换层析实验,以0-1 mol/L NaCl梯度洗脱方法纯化得到了罗非鱼胶原蛋白的α1亚基,以0.13 mol/L NaCl与0.17 mol/L NaCl分步洗脱方法纯化得到了α2亚基。鱼类过敏患者血清的ELISA结果显示,胶原蛋白及其亚基均呈现了IgE结合活性,对于8份鱼类过敏患者血清,胶原蛋白的特异性IgE反应率为50 %、α1为37.5 %,α2为50 %。鱼类过敏患者血清的dot-blotting结果显示,罗非鱼和鲤鱼胶原蛋白均出现了特异性杂交斑点;western-blotting结果显示,罗非鱼胶原蛋白的α1、α2以及β亚基均出现了特异性的杂交条带,但α1、α2亚基单独与鱼类过敏患者血清未出现特异性的杂交条带。采用制备的兔抗罗非鱼胶原蛋白的多克隆抗体,对两种鱼肉粗提物的胶原成分进行了检测。从两种粗提物中均检测到了特异性杂交条带,分子量大约为100 kDa与200 kDa。在罗非鱼粗提物中62 kDa处额外检测到了一条带,推测为胶原蛋白的降解产物。对于鲤鱼粗提物经加热后的样品进行了检测,结果显示在47.5-100 kDa处出现了特异性杂交条带,推测为胶原蛋白降解产物。本文纯化得到了罗非鱼,鲤鱼胶原蛋白以及罗非鱼胶原蛋白α1、α2亚基,以罗非鱼胶原蛋白制备了动物抗体,用于鱼类胶原蛋白的IgG检测。本文比较了胶原蛋白与小清蛋白的稳定性、罗非鱼胶原蛋白与α1、α2亚基的IgE结合活性。结果提示鱼类胶原蛋白及其亚基均为潜在的过敏原。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章引言  12-18
  1.1 食物过敏概述  12
  1.2 食物过敏原及其一般特性  12-13
  1.3 水产品过敏原  13
  1.4 食物脱敏技术  13-14
  1.5 胶原蛋白及其过敏原性研究  14-16
  1.6 本文的研究目的与意义  16-18
第2章材料与方法  18-29
  2.1 材料  18-20
    2.1.1 原料  18
    2.1.2 试剂  18
    2.1.3 实验所用溶液及其配制  18-20
    2.1.4 实验仪器  20
  2.2 实验方法  20-29
    2.2.1 蛋白粗提物的制备  20
    2.2.2 胶原蛋白的分离纯化  20-21
    2.2.3 胶原蛋白性质的分析  21-22
    2.2.4 动物抗体的制备  22
    2.2.5 胶原蛋白亚基的分离纯化  22-23
    2.2.6 模拟胃液消化实验（SGF）  23
    2.2.7 罗非鱼胶原蛋白的模拟胃肠液组合消化（二相）实验  23
    2.2.8 SDS-PAGE  23-26
    2.2.9 双向电泳  26
    2.2.10 western-blotting 和dot-blotting  26-27
    2.2.11 IgE- ELISA  27-28
    2.2.12 鱼类胶原蛋白的IgG-western-blotting 检测  28-29
第3章结果与分析  29-50
  3.1. 胶原蛋白的纯化  29-30
  3.2 胶原蛋白的鉴定  30-32
    3.2.1 双向电泳鉴定  30
    3.2.2 western-blotting 鉴定  30-31
    3.2.3 变性温度  31-32
  3.3 胶原蛋白的稳定性  32-40
    3.3.1 胶原蛋白的消化稳定性  32-34
    3.3.2 胶原蛋白的热稳定性  34-37
    3.3.3 胶原蛋白的pH 稳定性  37-38
    3.3.4 高温高压对胶原蛋白稳定性的影响  38-39
    3.3.5 超声处理对胶原蛋白稳定性的影响  39-40
  3.4 胶原蛋白亚基的纯化  40-43
  3.5 胶原蛋白及其亚基的IgE 结合活性  43-45
  3.6 鱼类胶原蛋白的IgG 检测  45-50
第4章结论与讨论  50-57
  4.1 胶原蛋白的分离纯化及性质分析  50-51
  4.2 胶原蛋白稳定性  51-52
  4.3 胶原蛋白及其亚基的IgE 结合活性  52-54
  4.4 鱼类胶原蛋白的IgG 检测  54-55
  4.5 结论与展望  55-57
    4.5.1 结论  55
    4.5.2 展望  55-57
致谢  57-58
参考文献  58-62
在学期间发表的学术论文  62

鱼类胶原蛋白的分离纯化及其过敏原性研究

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