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AQP1-shRNA重组腺病毒质粒功能鉴定

作　者: Abdulhakim Abdulmajid Abdulwali Al-Sadhi（哈提木）
导　师: 李晓萌
学　校: 东北师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: AQP1 shRNA 腺病毒载体 细胞迁移
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


水通道蛋白(AQPs)是细胞膜上特异性转运水的孔道。之前的研究表明AQP1普遍表达于肿瘤血管内皮,并且在其他的许多肿瘤细胞中也有表达。但是,其表达是否是一种异常现象,或者其在肿瘤生物学中是否为关键因素,这些在AQPs的表达研究中仍不清楚。对于水通道蛋白1(AQP1)的研究历史短暂,现在对于它的研究还不能完全表明其在机体内的作用机制。本研究构建AQP1的shRNA的腺病毒质粒,并利用AQP1-shRNA重组腺病毒质粒干涉内源性表达的AQP1及外源性表达的AQP1,研究了AQP1和细胞水转运功能和细胞运动性之间的关系。首先采用包括入门载体pENTR2B和目的载体pAd/CMV/V5-DEST在内的腺病毒载体系统,并利用DNA重组技术以及LR反应构建AQP1-shRNA重组腺病毒质粒,再使用双抗生素筛选、不同感受态细胞转化筛选以及限制性内切酶酶切鉴定其正确性。然后将分子水平鉴定正确的AQP1-shRNA重组腺病毒质粒转染到表达外源性AQP1的CHO细胞以及表达内源性AQP1的肝癌细胞SMMC7221中,并通过Western blot实验和免疫荧光实验对AQP1-shRNA重组腺病毒质粒进行功能鉴定,结果证明AQP1-shRNA重组腺病毒质粒不仅可以沉默外源性的hAQP1还可以沉默内源性hAQP1基因表达,并且以第二个质粒即hAQP1-shRNA2沉默效果最为显著。之后利用MTT实验、细胞膜水通透性实验、划痕实验以及Western blot实验研究转染AQP1-shRNA重组腺病毒质粒后通过沉默外源性AQP1以及内源性AQP1表达进而研究AQP1和细胞水转运功能以及细胞运动性的关系,结果说明AQP1-shRNA重组腺病毒质粒既可以显著干涉CHO细胞中外源性AQP1对水的通透性,又可以干涉肝癌细胞SMMC7221中内源性糖基化的AQP1对水的通透性,并且AQP1-shRNA重组腺病毒质粒沉默AQP1后,细胞运动性受到显著地抑制,同时AQP1可能通过细胞骨架的重建修复来参与细胞的运动。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 引言  9-15
  1.1 水通道蛋白的发现  9
  1.2 水通道蛋白亚家族及结构  9-11
    1.2.1 水通道蛋白三大亚家族  9-10
    1.2.2 水通道蛋白的结构  10-11
  1.3 水通道蛋白分布  11-13
    1.3.1 泌尿系统中的水通道蛋白  11-12
    1.3.2 呼吸系统中的水通道蛋白  12
    1.3.3 消化系统中的水通道蛋白  12
    1.3.4 生殖系统中的水通道蛋白  12
    1.3.5 神经系统中的水通道蛋白  12-13
    1.3.6 肿瘤组织和水通道蛋白  13
  1.4 siRNA 干扰技术的研究进展  13-14
  1.5 本研究的目的和意义  14-15
2 实验材料和方法  15-22
  2.1 实验材料  15-16
    2.1.1 主要生化和分子生物学试剂  15
    2.1.2 质粒及载体  15
    2.1.3 细胞系  15
    2.1.4 主要实验仪器和耗材  15-16
  2.2 实验方法  16-22
    2.2.1 感受态细胞 DH5α 和 DB3.1 的制备  16
    2.2.2 pENTR2B 和 pAd/CMV/V5-DEST 载体的扩增  16
    2.2.3 初始克隆重组体的构建与鉴定  16-18
    2.2.4 重组腺病毒质粒的构建与鉴定  18
    2.2.5 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒的包装  18-19
    2.2.6 细胞培养和感染  19-20
    2.2.7 免疫荧光检测  20
    2.2.8 Western Blot 检测  20-21
    2.2.9 细胞膜水通透性的检测  21
    2.2.10 MTT 检测  21
    2.2.11 平板单层损伤愈合检测  21-22
3 结果  22-33
  3.1 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒的构建  22-27
    3.1.1 shRNA 质粒与 pENTR2B 载体的重组  22-24
    3.1.2 重组腺病毒质粒的构建结果与鉴定  24-27
  3.2 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒的功能鉴定  27-29
    3.2.1 外源性AQP1 与内源性AQP1 表达方式不同  27
    3.2.2 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒对hAQP1 的干涉作用  27-29
  3.3 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒对 AQP1 水转运功能的影响  29-31
    3.3.1 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒显著干涉外源性AQP1 对水的通透性  29-30
    3.3.2 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒显著干涉内源性AQP1 对水的通透性  30-31
  3.4 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒对细胞运动性的影响  31-33
    3.4.1 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒干涉非糖基化的AQP1 抑制细胞的运动性  31-32
    3.4.2 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒干涉糖基化的AQP1 显著抑制细胞的运动性  32-33
4 讨论  33-35
  4.1 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒鉴定  33
  4.2 AQP1-shRNA 重组腺病毒质粒功能鉴定  33
  4.3 AQP1 介导的水转运功能  33-34
  4.4 AQP1 在细胞迁移过程中的作用分析  34-35
结论  35-36
参考文献  36-40
致谢  40

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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