学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

基于Hep G2细胞膜表面HSP70的免疫应用研究

作　者: 崔乃忠
导　师: 徐永平
学　校: 大连理工大学
专　业: 药物工程
关键词: 热诱导 Hep G2 细胞膜表面蛋白肿瘤热疗免疫毒素
分类号: R730.51
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 8次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

抗肿瘤药物对机体正常细胞的细胞毒性及肿瘤细胞多药耐药性机制始终是抗肿瘤治疗的主要障碍。抗肿瘤靶向药物虽然有较低的细胞毒性和可选择性杀伤肿瘤细胞的作用,但多数靶向药物通常基于肿瘤细胞与正常细胞间差异性抗原研制,故在肿瘤细胞发生抗原漂移和抗原调变时常使抗肿瘤靶向药物的疗效减弱,甚至失去疗效。在探索抗肿瘤治疗途径过程中,人们发现热疗法可在不伤害机体正常细胞的情况下选择性杀伤肿瘤细胞,而且还可通过热诱导作用使肿瘤细胞的免疫原性增强,从而有助于机体免疫系统对肿瘤细胞的识别,进而增强机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。然而,单纯依靠热疗方法进行抗肿瘤治疗,存在疗效低、治疗不彻底等缺点,因此热疗法通常与其它抗肿瘤治疗方法联合使用。热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是高度保守的细胞蛋白质家族之一,肿瘤热疗、化疗等因素都可诱导产生热休克蛋白。HSPs可通过多肽结合阈与肿瘤细胞内不同的肿瘤相关抗原结合形成复合物并激活免疫系统。有研究表明,肿瘤细胞内HSPs水平显著高于正常组织细胞；在肿瘤细胞膜表面可检测到HSPs,而相同条件下正常细胞膜表面却检测不到HSPs。但是,肿瘤细胞经热诱导后细胞膜表面蛋白水平是否存在规律性变化以及能否用于抗肿瘤治疗鲜见报道。为此,本研究首先考察经热诱导后人肝癌Hep G2细胞膜表面蛋白水平是否存在规律性变化。由于HSP70是肿瘤细胞膜表面的主要热诱导蛋白,故先采用流式细胞术等方法对热诱导后Hep G2细胞膜表面HSP70水平的动态变化情况进行研究。在此基础上,采用经热诱导的Hep G2细胞免疫BALB/c小鼠,通过免疫学和基因工程的方法构建单链抗体文库,然后利用核糖体展示和免疫亲和筛选方法,获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体,进而构建特异性单链抗体重组免疫毒素基因并对其表达的融合蛋白特异性、亲和性以及抗肿瘤活性进行检测。研究显示Hep G2细胞膜表面HSP70水平在42℃热诱导后37℃恢复培养12h出现峰值,同时细胞膜表面可检测到HSP70的细胞百分数显著增加(由7.85%增加到15.11%)。采用核糖体展示技术成功筛选获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体克隆(scfv5669和scfv5670),进而成功构建单链抗体重组免疫毒素(scfv5669-seb).分析显示：scfv5669-seb融合蛋白保有单链抗体和金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白的结构和空间构象,不与入正常肝细胞系L-02细胞结合,对热诱导后Hep G2细胞特异性、亲和性及肿瘤生长抑制率显著高于未经热诱导的Hep G2细胞(P<0.05)。综上可见,热诱导后Hep G2细胞膜表面HSP70水平随时间延长而增加,达峰值后随时间延长而降低并趋于恢复到热诱导前水平。热诱导后恢复培养期间,Hep G2细胞膜表面HSP70水平出现峰值时,细胞膜表面可检测到HSP70的细胞百分数显著增加(P<0.05)。以此为基础,成功获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体克隆(scfv5669和scfv5670)并成功构建单链抗体重组免疫毒素(scfv5669-seb)。经实验检测scfv5669-seb表达融合蛋白具有较好的特异性、亲和性和抗肿瘤活性。本研究为利用热诱导后Hep G2细胞膜表面蛋白水平规律性变化构建新型抗肿瘤免疫毒素、协同肿瘤热疗提供依据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
縮略词表  8-14
1 绪论  14-43
  1.1 背景意义  14-15
  1.2 国内外进展  15-41
    1.2.1 肿瘤概述  15-17
    1.2.2 肿瘤与免疫  17-20
    1.2.3 抗肿瘤药物研究进展  20-24
    1.2.4 抗肿瘤靶向药物及作用靶点选择研究进展  24-29
    1.2.5 细胞对温度变化的耐受性及应用  29-34
    1.2.6 小分子抗体研究进展  34-36
    1.2.7 超抗原与金黄色葡萄球菌肠毒素  36-38
    1.2.8 核糖体展示技术研究进展  38-41
  1.3 论文选题依据及研究内容  41-43
    1.3.1 选题依据  41
    1.3.2 研究内容  41-43
2 热诱导后Hep G2 细胞膜表面蛋白水平的动态研究  43-53
  2.1 引言  43
  2.2 实验材料  43-45
    2.2.1 细胞系  43
    2.2.2 试剂  43-44
    2.2.3 溶液配制  44-45
  2.3 实验方法  45-47
    2.3.1 细胞培养  45
    2.3.2 热诱导Hep G2细胞膜表面蛋白水平酶联免疫吸附技术检测  45
    2.3.3 热诱导Hep G2细胞膜表面蛋白水平免疫细胞化学检测  45-46
    2.3.4 热诱导Hep G2细胞膜表面蛋白水平免疫荧光技术检测  46-47
    2.3.5 热诱导Hep G2细胞膜表面蛋白水平流式细胞术检测  47
    2.3.6 统计分析  47
  2.4 实验结果  47-50
    2.4.1 热诱导后Hep G2细胞膜表面蛋白水平酶联免疫吸附技术检测结果  47-48
    2.4.2 热诱导后Hep G2细胞膜表面蛋白水平免疫细胞化学检测结果  48-49
    2.4.3 热诱导后Hep G2细胞膜表面蛋白水平免疫荧光技术检测结果  49
    2.4.4 热诱导后Hep G2细胞膜表面蛋白水平流式细胞术检测结果  49-50
  2.5 讨论  50-52
  2.6 小结  52-53
3 单链抗体文库的构建  53-66
  3.1 引言  53
  3.2 实验材料  53-55
    3.2.1 细胞系  53
    3.2.2 质粒与菌株  53
    3.2.3 实验动物  53
    3.2.4 试剂  53-54
    3.2.5 溶液配制  54-55
  3.3 实验方法  55-62
    3.3.1 细胞培养  55
    3.3.2 细胞热诱导及动物免疫  55-56
    3.3.3 小鼠淋巴细胞提取  56
    3.3.4 小鼠脾淋巴细胞总RNA提取  56
    3.3.5 反转录成cDNA  56-57
    3.3.6 PCR扩增鼠V_H、V_L片段及scFv基因组装  57-60
    3.3.7 ScFv文库的构建及鉴定  60-62
  3.4 实验结果  62-64
    3.4.1 动物免疫及血清效价测定  62
    3.4.2 小鼠脾淋巴细胞总RNA提取及反转录cDNA  62-63
    3.4.3 PCR扩增鼠V_H、V_L片段及scFv基因组装结果  63
    3.4.4 ScFv文库的构建及鉴定结果  63-64
  3.5 讨论  64-65
  3.6 小结  65-66
4 核糖体展示技术筛选特异性单链抗体克隆  66-88
  4.1 引言  66
  4.2 实验材料  66-70
    4.2.1 细胞系  66
    4.2.2 质粒与菌株  66
    4.2.3 引物合成  66-67
    4.2.4 试剂  67
    4.2.5 溶液的配制  67-70
  4.3 实验方法  70-80
    4.3.1 V_H/k文库的构建  70-73
    4.3.2 核糖体展示及免疫亲和筛选  73-75
    4.3.3 特异性scFv基因克隆  75-76
    4.3.4 序列测定与分析  76
    4.3.5 特异性scFv基因表达及表达产物纯化  76-78
    4.3.6 特异性scFv基因表达产物初步鉴定  78-80
  4.4 结果与分析  80-86
    4.4.1 V_H/k文库的构建及亲和筛选结果  80-81
    4.4.2 序列分析  81-82
    4.4.3 特异性scFv基因表达及表达产物纯化结果  82
    4.4.4 特异性scFv基因表达产物性质初步鉴定结果  82-86
  4.5 讨论  86-87
  4.6 小结  87-88
5 特异性单链抗体重组免疫毒素的构建及鉴定  88-114
  5.1 引言  88
  5.2 实验材料  88-89
    5.2.1 细胞系  88
    5.2.2 质粒与菌株  88
    5.2.3 引物合成  88-89
    5.2.4 试剂  89
    5.2.5 溶液的配制  89
  5.3 实验方法  89-98
    5.3.1 金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆  89-92
    5.3.2 融合蛋白基因初步生物信息学预测  92
    5.3.3 融合蛋白基因(scfv5669-seb)质粒构建及鉴定  92-95
    5.3.4 融合蛋白基因(scfv5669-seb)表达及产物纯化  95-96
    5.3.5 融合蛋白基因(scfv5669-seb)表达产物鉴定  96-97
    5.3.6 MTT法测定scfv5669-seb融合蛋白体外抗肿瘤作用效果  97
    5.3.7 统计分析  97-98
  5.4 实验结果  98-112
    5.4.1 金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆结果  98-100
    5.4.2 融合蛋白基因初步生物信息学预测结果  100-102
    5.4.3 融合蛋白基因(scfv5669-seb)质粒构建及鉴定结果  102-109
    5.4.4 融合蛋白基因(scfv5669-seb)表达及产物纯化结果  109-110
    5.4.5 融合蛋白基因(scfv5669-seb)表达产物鉴定结果  110-111
    5.4.6 MTT法测定scfv5669-seb融合蛋白体外抗肿瘤作用结果  111-112
  5.5 讨论  112-113
  5.6 小结  113-114
结论与展望  114-116
  结论  114
  展望  114-116
创新点摘要  116-117
参考文献  117-126
附录A 主要仪器及设备  126-128
附录B 序列测定与分析  128-133
致谢  133-134
作者简介  134-135
攻读博士学位期间发表学术论文情况  135-136

基于Hep G2细胞膜表面HSP70的免疫应用研究

内容摘要

全文目录

相似论文