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蜂毒素与基因变构人白细胞介素-2融合基因的原核质粒构建、表达、纯化及活性测定

作　者: 郑旭
导　师: 王斌
学　校: 青岛大学
专　业: 病原生物学
关键词: 免疫毒素 蜂毒肽 白细胞介素-2 原核表达 活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的构建免疫毒素——蜂毒肽与变构人白细胞介素-2融合基因的原核表达质粒;并通过对其诱导表达而探讨其对宿主菌E.coli.生长的影响,筛选稳定表达宿主菌株,表达发酵,目的蛋白定位分析;对可溶部分进行纯化,得到目的蛋白;研究目的蛋白在体外的生物学活性。方法以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR的方法定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala);目的基因进行T-A克隆,经NcoⅠ和HindⅢ双酶切、DNA序列测定分析鉴定,正确克隆命名为pMD18-T/M-IL-2(88Arg,125Ala);如上双酶消化克隆质粒和pET-32a（+）后回收片段连接,构建表达质粒,同样双酶切鉴定,正确克隆命名为pET/M-IL-2(88)Arg,125Ala)。表达质粒转化宿主菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;ELISA分析表达产物;测定诱导不同时间宿主菌的OD600值并绘制生长曲线及对诱导不同时间的宿主菌进行活菌计数;28℃,1mM IPTG再诱导存活重组菌,SDS-PAGE凝胶电泳和Western-Blotting分析表达产物;扩大培养,经过亲和层析、Enterokinase酶切和离子交换层析进行纯化,BCA法进行融合蛋白浓度测定。用液相测定法研究融合蛋白的抑菌活性,用MTT法研究融合蛋白对外周血单个核细胞增殖和对Hela细胞生长抑制的作用。利用方差分析处理数据。结果目的片段长542bp,测序分析重组子如预期突变,无缺失、插入及框移;ELISA检测到目的蛋白表达。重组子诱导表达两小时宿主菌OD600值由0.8下降至0.6;活菌计数由108/ml降至104/ml;SDS-PAGE凝胶电泳和Western-Blotting分析存活重组菌再表达产物见约37kDa处目的蛋白可溶和非可溶均有表达;对可溶部分初步纯化后,每升菌液可得融合蛋白62μg。纯化后的融合蛋白抑菌率呈浓度依赖性;对外周血单个核细胞增殖作用与IL-2的差异不具有显著性（p>0.05）;对Hela细胞生长的抑制作用与IL-2的具有显著性差异（p<0.05）结论成功构建了原核表达质粒pET/M-IL-2(88Arg,125Ala);该融合蛋白的表达对宿主菌具有杀伤作用,质粒丢失情况严重;筛选出变异的耐受宿主菌株,可以进行稳定表达;对表达产物的可溶部分进行纯化,得到了M-IL-2(88Arg)免疫毒素融合蛋白;该免疫毒素融合蛋白具有抗菌、增强免疫功和抑制恶性肿瘤细胞增殖等良好的体外生物学活性。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-7
引言  7-8
第一章 材料和方法  8-20
  1.1 质粒和菌株  8
  1.2 试剂  8-9
  1.3 仪器  9
  1.4 克隆质粒的构建及鉴定  9-12
    1.4.1 PCR定点突变  9-10
    1.4.2 克隆质粒的构建  10
    1.4.3 克隆质粒的筛选与鉴定  10-12
  1.5 表达质粒的构建及鉴定  12-13
    1.5.1 双酶切目的片段及表达质粒  12-13
    1.5.2 切胶回收目的基因片段与表达载体片段  13
    1.5.3 目的基因片段与表达质粒片段的连接  13
    1.5.4 表达质粒的筛选与鉴定  13
  1.6 重组免疫毒素的表达、纯化及鉴定  13-17
    1.6.1 诱导表达  13
    1.6.2 ELISA分析  13-14
    1.6.3 诱导后存活宿主菌的筛选  14
    1.6.4 分析表达产物的可溶及非可溶部分  14-15
    1.6.5 重组免疫毒素的纯化及鉴定  15-16
    1.6.6 SDS-PAGE电泳  16-17
    1.6.7 Western Blotting鉴定  17
  1.7 重组免疫毒素的定量及保存  17-18
  1.8 活性实验  18-19
    1.8.1 重组免疫毒素的抑菌活性  18
    1.8.2 融合蛋白对外周血单核细胞(PBMC)增殖的作用  18
    1.8.3 对人宫颈肿瘤细胞Hela生长增殖的作用  18-19
  1.9 液体配置  19
  1.10 统计方法  19-20
第二章 结果  20-28
  2.1 PCR定点突变及表达质粒的构建  20-22
  2.2 ELISA检测诱导表达产物  22
  2.3 诱导后存活宿主菌的筛选  22-24
    2.3.1 重组菌的生长曲线及活菌计数  22-23
    2.3.2 诱导后存活菌的再诱导表达  23-24
  2.4 表达产物可溶和非可溶部分分析  24
  2.5 目的蛋白的纯化、鉴定及浓度测定  24-26
    2.5.1 SDS-PAGE电泳检测  24-25
    2.5.2 Western-Blotting鉴定  25-26
  2.6 体外活性实验  26-28
    2.6.1 抑菌活性  26
    2.6.2 融合蛋白对PBMC增殖的作用  26-27
    2.6.3 融合蛋白对Hela细胞生长增殖的抑制作用  27-28
第三章 讨论  28-34
  3.1 免疫毒素  28-29
  3.2 PCR定点突变  29-30
  3.3 表达系统的选择、毒性蛋白表达和耐受宿主菌的筛选  30-32
    3.3.1 表达系统的选择  30
    3.3.2 毒性蛋白的表达  30-31
    3.3.3 毒素耐受宿主菌的筛选  31-32
  3.4 蛋白纯化工艺的初步探索  32-33
  3.5 生物学活性的探讨  33-34
第四章 结论  34-35
参考文献  35-38
综述:免疫毒素构建及应用的研究进展  38-53
  参考文献  46-53
攻读学位期间成果  53-54
致谢  54-56

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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