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MiR-29b通过调控滋养层细胞功能参与PE发病机制的研究

作　者: 李鹏飞
导　师: 侯亚义
学　校: 南京大学
专　业: 生物学
关键词: 子痫前期微小RNA 芯片胎盘滋养层细胞
分类号: R714.245
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：子痫前期(preeclampsia, PE)是妊娠期特有的疾病,以妊娠20周后出现高血压、蛋白尿为主要特征,是引起孕产妇和围生儿发病及死亡的主要原因。迄今为止,其潜在的发病机制不详。目前临床上迫切需要寻找可靠的PE的早期预测指标。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一种短(19-25nt)的非编码的内源性RNA,通过与靶mRNA的3’非翻译区结合来促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译从而发挥负调控基因表达的作用。MiRNA参与多种生物学过程的调控,包括发育、分化、凋亡以及癌症的发生。最近报道,人类胎盘中表达大量的miRNA。但其表达类型与病理关系的报道很少。目前,还不清楚哪些miRNAs参与了重度PE患者的发病过程,这些miRNAs对滋养层细胞功能的调节如何,其在PE的发病过程中扮演的角色如何,这都是亟待解决的问题。研究内容：1.利用miRNA芯片筛选可能与PE有关的miRNA方法：收集2005年3月至2008年8月在南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科就医且行剖宫产的24例重度PE患者和26例正常妊娠的胎盘组织。采用哺乳动物miRNA表达谱芯片筛选了正常妊娠(4例)与重度PE(4例)胎盘组织中差异表达显著的miRNA,结果用微阵列显著性分析(Significance Analysis of Microarrays，SAM)以及聚类分析(cluster analysis)软件分析。应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)在24例重度PE和20例正常妊娠胎盘中验证上调倍数较大的7个miRNAs。随后利用TargetScan、PicTar与miRBase网站预测这7个miRNAs的靶基因,用基因本体论(Gene Ontology, GO)进一步分析这些靶基因可能参与的生物学过程。结果：重度PE胎盘与正常胎盘组织中存在27个差异表达的miRNAs。其中,20个miRNAs在重度PE胎盘中表达升高,7个1miRNAs表达下降。应用Real-time PCR验证其中上调倍数较大的7个miRNAs,发现miR-16、miR-29b、 miR-195、miR-26、miR-181a、miR-335和miR-222在PE胎盘中显著升高(均为P<0.05),变化倍数分别为2.51、2.51、3.32、2.25、4.67、2.22、2.58。这与芯片结果相符。进一步对它们进行靶基因预测及GO分析发现,这些靶基因参与多种生物学过程诸如信号传导、细胞死亡、免疫应答、细胞增殖、发育等。2.揭示miR-29b调控滋养层细胞功能的分子机制方法：选择PE胎盘组织中表达差异较为显著的miR-29b用生物信息学方法：TargetScan、PicTar、miRBase以及GO、Pathway分析其靶基因的情况及可能参与的生物学过程及信号通路。体外实验以人滋养层细胞系HTR8/SVneo、 BeWo和JAR为研究对象,Real-time PCR检测不同细胞系miR-29b的本底表达水平。利用基因转染技术使miR-29b高表达或抑制表达,在此基础上检测其对滋养层细胞生物学行为如增殖、凋亡、周期、浸润及成血管等的影响。生物信息学预测miR-29b的靶基因,Real-time PCR、免疫印迹(Western Blot)以及酶标记免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)验证这些靶基因的表达水平,并通过荧光素酶报告系统进一步验证其作用位点。紧接着,Western Blot检测miR-29b对细胞外信号调控激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase-1and-2, ERK1/2)以及局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)信号通路的影响。结果：PE患者胎盘组织中miR-29b表达升高。miR-29b可能参与细胞增殖、凋亡、浸润以及粘附等等重要的生物学过程,参与黏着斑激酶、血管内皮生长因子、p53以及细胞色素P450等信号通路,参与半胱氨酸代谢、甘油代谢、代谢信号通路等。miR-29b不影响滋养层细胞的增殖及周期,但能诱导滋养层细胞的凋亡、降低滋养层细胞的浸润以及抑制滋养层细胞HTR-8/SVneo的成血管能力。改变miR-29b的表达能影响髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemin-1, Mcl-1)、基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase2, MMP2)、血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor, VEGFA)和整合素β1(integrin β1)的mRNA及蛋白质水平的表达。荧光素酶报告系统证实Mcl-1、 MMP2、VEGFA和integrin β1是miR-29b的靶基因。miR-29b抑制滋养层细胞FAK蛋白的磷酸化。3.阐明miR-29b在重度PE发病中的作用机制方法：收集临床样本,通过Real-time PCR验证miR-29b及其靶基因在正常妊娠和重度PE患者胎盘组织中的表达水平,并分析两者的相关性。结果：miR-29b在重度PE胎盘中表达升高,靶基因MMP2、Mcl-1、VEGFA和integrin β1表达降低,而且miR-29b和这些靶基因表达水平呈负相关。结论：1.本研究初步筛选出了重度PE胎盘组织的一系列表达失衡的miRNAs。2.首次揭示了miR-29b可通过调控靶基因MMP2、Mcl-1、VEGFA和integrinβ1参与胎盘滋养层细胞的凋亡、浸润和血管生成。3.阐明了miR-29b在PE发病机制中作用,提示miR-29b可能作为PE的诊断、治疗靶点。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-12
缩略词表  12-14
目录  14-16
第一章绪论  16-33
  引言  16
  1 miRNA在PE的研究进展  16-19
    1.1 miRNA在PE的研究进展(胎盘组织与外周血)  16-18
    1.2 miRNA在滋养层细胞中功能的研究进展  18-19
  2 miR-29的研究进展  19-27
    2.1 基因位置  20
    2.2 miR-29表达的调控  20-21
    2.3 细胞效应  21-23
    2.4 心血管和肾脏生理和病理的相关性  23-25
    2.5 展望  25-27
  参考文献  27-33
第二章重度PE和正常妊娠胎盘中miRNA差异表达的研究  33-48
  引言  33
  2 实验材料和方法  33-38
    2.1 研究对象  33-34
    2.2 主要仪器和试剂  34-35
    2.3 方法  35-37
    2.4 统计学处理  37-38
  3 结果  38-44
    3.1 重度PE胎盘中差异表达的miRNA  38-40
    3.2 差异表达miRNA的验证  40-41
    3.3 miRNAs芯片结果的生物信息学分析  41-44
  4 讨论  44-46
  5 结论  46
  参考文献  46-48
第三章 miR-29b调节滋养层细胞生物学行为的影响及可能的机制  48-85
  1 引言  48-49
  2 资料与方法  49-61
    2.1 主要仪器和试剂  49-50
    2.2 方法  50-61
    2.3 统计学处理  61
  3 结果  61-77
    3.1 miR-29b的靶基因及其生物学意义  61-65
    3.2 miR-29b在胎盘组织和滋养层细胞系中的表达情况  65
    3.3 miR-29b不影响滋养层细胞的增殖  65-66
    3.4 miR-29b不影响滋养层细胞周期各期的比例  66-67
    3.5 miR-29b促进滋养层细胞的凋亡  67-69
    3.6 miR-29b抑制滋养层细胞的浸润能力  69-72
    3.7 miR-29b降低滋养层细胞的成血管  72
    3.8 miR-29b下游靶基因生物信息学预测  72-73
    3.9 miR-29b下游靶基因生物学验证  73-76
    3.10 miR-29b对信号通路的影响  76-77
  4 讨论  77-79
  5 结论  79-80
  参考文献  80-85
第四章 PE患者靶基因的表达水平及其与miR-29b的相关性  85-93
  1 引言  85
  2 实验材料和方法  85-86
    2.1 研究对象  85
    2.2 主要仪器和试剂  85-86
    2.3 总RNA提取  86
    2.4 实时定量PCR检测mRNA  86
    2.5 统计学处理  86
  3 结果  86-89
    3.1 重度PE患者胎盘组织中Mcl-1、MMP2、VEGFA和integrin β1的表达水平显著低于正常人  86-87
    3.2 重度PE患者胎盘组织Mcl-1、MMP2、VEGFA和integrin β1的表达水平与miR-29b成负相关  87-88
    3.3 PE发病机制示意图  88-89
  4 讨论  89-91
  5 结论  91
  参考文献  91-93
全文总结  93-94
附录：试剂配方  94-96
博士研究生期间发衰及待发表的论文  96-98
参与的学术会议  98-99
致谢  99-100
感谢以下基金的资助  100-101

MiR-29b通过调控滋养层细胞功能参与PE发病机制的研究

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