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C3G/Rapl信号通路中Rapl表达对Rapl酶活性及卵巢癌恶性浸润能的贡献

作　者: 高一萌
导　师: 令狐华
学　校: 重庆医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 人卵巢癌 Rap1 C3G SKOV3细胞株 RNAi
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：探讨C3G/Rap1信号通路中Rap1蛋白对Rap1酶活性及卵巢癌恶性浸润能的贡献,并分析其可能的机制。方法：1.免疫印迹检测验证上皮性卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达相关性；免疫组化比较卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达趋势；免疫荧光观察SKOV3中Dock180与C3G及它们各自的下游蛋白Racl/Rap1的定位。2.免疫印迹检测并比较Rap1在上皮性卵巢癌组织、卵巢良性组织和正常卵巢组织中的表达。3.应用RNA干扰技术构建三个Rapl shRNA真核表达载体；用LipofectamineTM2000将三个重组质粒、空质粒、阴性质粒分别转染进卵巢癌细胞株SKOV3,通过免疫印迹对重组质粒进行有效性筛选,G418筛选建立SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株。4.观察Rap1基因沉默后卵巢癌细胞株SKOV3中Rap1酶活性的变化及其生物学行为的影响：免疫荧光观察焦点粘连的形成,MTT实验、划痕愈合实验、Matrigel Transwell侵袭实验检测细胞的恶性表型,明胶酶谱法检测明胶酶活性的变化,GST-pull down实验检测Rap1酶活性的改变。结果：1.Dock180与C3G在卵巢癌组织中的表达呈现相反趋势；C3G/Dock180均主要分布于胞质,下游效应蛋白Rap1/Rac1在胞膜和胞质都有表达,但Rap1以胞质为主,而Rac1可以伸展至胞膜及胞膜皱褶。2.与卵巢良性组织和正常卵巢组织相比,卵巢癌组织中Rap1呈现高表达(P<0.05)。3.设计三个针对人Rap1基因的三个siRNA片段,经双酶切和DNA测序证实成功构建了三个重组质粒pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-#1,-Rap1i-#2,及-Rap1i-#3。瞬时转染提示质粒pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-#1,-Rap1i-#2,及-Rap1i-#3的Rap1抑制效率分别是50%,66%,19%,遂最终采用pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-#2转染并用G418筛选出单克隆细胞Rapli-1和Rapli-2,其Rap1蛋白抑制率分别为70%和48%,我们选取Rapli-1细胞进一步验证Rap1沉默后细胞表型及Rap1酶活性的变化。4.与对照组相比,Rap1沉默的细胞组肿瘤细胞焦点粘连的数量以及肌动蛋白微丝骨架都无明显变化,但表现出细胞增殖速度增快,细胞损伤修复能力增强,而穿过基底膜的细胞数量明显下降,明胶酶的产生减少,Rap1酶的活性明显减弱。结论：我们的研究结果显示,Rap1对上皮性卵巢癌的侵袭和转移具有促进作用,而它对细胞增殖作用可能受其他信号途径的影响,需要进一步深入研究。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-15
  参考文献  13-15
第一部分 C3G/Rap1及Dock180/Rac1信号蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及分布  15-31
  1 实验材料和方法  15-23
  2 结果  23-27
  3 讨论  27-29
  参考文献  29-31
第二部分 Rap1基因shRNA真核表达载体的构建及SKOV3-Rap1i稳定转染细胞株的建立  31-54
  1 实验材料和方法  32-43
  2 结果  43-49
  3 讨论  49-52
  参考文献  52-54
第三部分 RNAi抑制Rap1基因表达对人卵巢癌细胞株SKOV3生物学特性的影响  54-70
  1 实验材料和方法  54-59
  2 结果  59-65
  3 讨论  65-68
  参考文献  68-70
全文总结  70-71
文献综述：Rap1 GTP酶的生物学功能研究进展  71-83
  参考文献  77-83
致谢  83-84
攻读硕士学位期间发表的文章  84

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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