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Cullin4B参与调控DNA甲基化介导的转录抑制进而促进宫颈癌发生

作　者: 杨阳
导　师: 龚瑶琴
学　校: 山东大学
专　业: 遗传学
关键词: CUL4B SUV39H1 DNA甲基化 IGFBP3 宫颈癌
分类号: R737.33
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

Cullin4B (CUL4B)属于cullin家族,是Cullin4B-Ring E3泛素连接酶复合体(CRL4B)的骨架蛋白。泛素-蛋白酶体途径被认为是生物体内最为主要的蛋白质选择性降解方式,参与调控了包括细胞周期、信号转导、病毒感染、生长发育等几乎所有的生命过程。参与调控泛素化过程的基因异常可以导致多种疾病,如肿瘤、神经系统发育障碍等。人类Cullin家族有8个成员,分别是CUL1,CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5, CUL7和PARC,其中CUL4A和CUL4B同源性最高,而在植物、裂殖酵母、线虫、果蝇等低等真核生物中,CUL4仅有一种蛋白。由于CUL4A与CUL4B高度同源,因此早期研究者常将两者作为一体(CUL4)来研究。但是随着研究的逐渐深入,发现CUL4A和CUL4B在功能上并不完全重叠,如敲除小鼠Cul4b基因会导致胚胎致死,人类CUL4B突变导致X-连锁智力低下综合征,说明CUL4A并不能完全补偿CUL4B在发育中的作用。有研究表明在裂殖酵母中,人类cullin4的同源蛋白pcu4蛋白的异常表达会导致异染色质形成障碍。在哺乳动物中CUL4B可以降解组蛋白H3K4甲基转移酶复合物中的核心组分WDR5,并且CUL4B可以结合多梳蛋白抑制复合物2(PRC2),通过单泛素化H2AK119从而发挥转录抑制作用。与CUL4A主要分布在细胞质不同,CUL4B具有独特的N端,其上含有核定位信号,从而使CUL4B主要分布于核内,也预示了CUL4B在细胞核内发挥重要作用。本研究发现CUL4B可以与组蛋白甲基转移酶SUV39H1.异染色质蛋白HP1以及DNA甲基转移酶DNMT3A相互作用,从而在由DNA甲基化介导的基因转录沉默中发挥重要作用。抑制CUL4B表达不仅使H2AK119的单泛素化修饰降低,同时H3K9的三甲基化和DNA甲基化水平也会减少,从而使某些基因如抑癌基因IGFBP3发生去抑制作用。我们证实CUL4B可以促进细胞增殖、迁移和肿瘤发生,至少在一定程度上是由于CUL4B抑制IGFBP3的表达所引起的。在人的宫颈癌组织样本中,CUL4B表达水平显著增高,并与IGFBP3的表达呈显著负相关。我们的研究建立了组蛋白泛素化／组蛋白甲基化和DNA甲基化在转录抑制作用中的分子作用模型,并且认识了CUL4B在宫颈癌发生中的分子作用机制。第一部分CUL4B相互作用蛋白的鉴定为了更好地理解CUL4B作用,我们使用免疫亲和纯化和质谱连用的方法寻找与CUL4B相互作用的蛋白。取得了以下研究结果：1、本实验室前期利用免疫亲和纯化结合质谱分析方法发现了一批CUL4B结合蛋白,其中有多种蛋白与表观遗传调控有关,本课题将对质谱检测到的DNMT3A,SUV39H1和HP1α/β/γ蛋白进行验证分析,这些蛋白均是介导DNA甲基化且与转录抑制相关的蛋白。首先我们采用Western blotting方法,用抗这些蛋白的特异性抗体对洗脱样品进行了分析,证实洗脱样品中存在DNMT3A, SUV39H1,PRMT5和HP1α/β/γ。2、为了证实CUL4B与SUV39H1/HP1/DNMT3A存在于一个复合物中,我们通过快速液相色谱(FPLC)方法对核蛋白提取物进行蛋白组分分离,然后用Western blotting方法进行检测,发现CUL4B, DDB1和ROC1与SUV39H1/HP1/DNMT3A的主峰都出现在669-1000kDa区域。提示CUL4B与SUV39H1/HP1/DNMT3A存在于一个复合物中。3、为进一步证明CUL4B与这些蛋白质间的相互作用,我们在HEK293T细胞和HeLa细胞中进行了免疫共沉淀(IP)分析。用抗CUL4B抗体进行IP,在沉淀蛋白质中我们用特异性抗体检测到SUV39H1, HP1α, HP1β,HP1γ, DNMT1, DNMT3A和DNMT3B,证实CUL4B可以与上述蛋白相结合。反之,我们分别用抗SUV39H1, HP1α, HP1β,HP1γ, DNMT1, DNMT3A和DNMT3B抗体进行IP,然后用抗CUL4B抗体进行IB检测,同样证实了这些蛋白可以与CUL4B相互结合。另外,在HEK293T和HeLa细胞中,SUV39H1, HP1α和DNMT3A也可以结合CRL4B复合物中的另外两个组分即DDB1和ROC1。从而进一步证实了CUL4B可以与SUV39H1/HP1/DNMTs相结合。4、为了理解CRL4B和SUV39H1/HP1/DNMTs复合物相互作用的分子机制,我们首先纯化了带有GST标签的GST融合蛋白即GST-CUL4B, GST-DDB1和GST-ROC1,同时在体外翻译了SUV39H1, HP1α, HP1β, HP1γ, DNMT1, DNMT3A和DNMT3B蛋白,通过GST pull-down实验证实了CUL4B和DDB1都可以直接结合SUV39H1, DNMT1, DNMT3A和DNMT3B。综上,通过免疫印迹(IB)、免疫共沉淀(IP)和GST pull-down等一系列分析,证实CRL4B和SUV39H1/HP1/DNMTs存在直接的相互作用。为理解CUL4B参与转录调控提供了一个新的分子作用机制。第二部分鉴定CRL4B/SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物调控的靶基因已有研究表明SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物的主要功能是甲基化DNA从而发挥转录抑制作用,基于我们发现CRL4B和SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物具有相互作用,于是我们检测了CRL4B/SUV39H1/HP1/DNMT3A可能共同调控的靶基因。取得了如下结果：1、向HeLa细胞中转染CUL4B的shRNA和shSCR载体,构建稳定干扰CUL4B表达的HeLa细胞系和对照HeLa细胞系,然后用抗5甲基胞嘧啶(5-mC)抗体对shCUL4B细胞及对照细胞进行甲基化DNA免疫沉淀芯片(MeDIP-chip)分析,从而检测抑制CUL4B表达对基因组DNA甲基化状态的影响。用5-mC抗体沉淀的甲基化DNAs通过无偏差扩增、标记,然后与含有人类基因组中从转录起始点的-800到+200范围的启动子区域共22,532个位点的芯片进行杂交(错配率低于0.05的情况下)。与对照细胞相比,我们发现总共有4045个基因组区域(1878个基因)在shCUL4B细胞中其甲基化水平有显著的差异,其中包括1965个在shCUL4B细胞中的高甲基化位点(953个基因)和2080个低甲基化位点(925个基因)。2、我们使用Molecule Annotation System软件对差异基因进行了信号通路分析(p值小于10-3)。与对照细胞相比,在shCUL4B细胞中总共将高甲基化和低甲基化的基因列出了主要的10个信号通路。在这些信号通路中选取了具有代表性的11个低甲基化的基因包括RPS6KA6,IGFBP3,AXIN1,SFRP5,FOXO3, WNT2B,IQGAP2,NKX3.1,RELN,KLF3和PER2,然后通过定量ChIP实验进一步分析这些基因启动子区域的甲基化水平。结果与MeDIP-chip分析结果基本一致。3、在MeDIP-chip检测到的基因中,胰岛素样的生长因子结合蛋白3(IGFBP3)是一个已知的抗增殖、促凋亡和抑制转移的蛋白。研究发现在多种癌症中IGFBP3启动子区域均存在异常高甲基化现象,包括肺癌,肝癌,胃癌,结肠癌,乳腺癌和宫颈癌。于是我们进一步分析CRL4B/SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物是否可以调控IGFBP3的表达。我们用抗CUL4B,DDB1,ROC1, SUV39H1,HP1α,HP1β和DNMT3A抗体进行了定量染色质免疫共沉淀(qChIP)实验,结果显示上述蛋白均可以结合在IGFBP3的启动子上。4、用组蛋白修饰抗体进行ChIP实验检测结果显示H2AK119ub1和H3K9me2/3的修饰以及DNA甲基化水平在IGFBP3的启动子上明显富集。5、在HeLa细胞中分别用抗CUL4B,DDB1,SUV39H1,HP1α,DNMT3A,5-mC和对照IgG抗体进行了染色质免疫共沉淀(ChIP)实验。结果表明CRL4B复合物和SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物都结合于IGFBP3的启动子上,同时5甲基胞嘧啶也存在于相同的启动子区域。为了证实CRL4B和SUV39H1/HP1/DNMT3A是作为同一个复合物存在于IGFBP3的启动子上,我们进行了ChIP/Re-ChIP实验。首先用抗CUL4B,DDB1,SUV39H1,HP1α,DNMT3A和5-mC的抗体进行第一轮染色质免疫共沉淀实验,然后将第一轮ChIP沉淀下来的样品再用其它上述抗体进行第二轮染色质免疫共沉淀实验。结果显示CRL4B和SUV39H1/HP1/DNMT3A是作为一个复合物结合在IGFBP3的启动子上。6、我们通过定量RT-PCR和Western blotting方法检测了干扰CUL4B表达对IGFBP3表达的影响。在HeLa, SiHa和Ca Ski细胞中干扰CUL4B会引起IGFBP3转录水平及其蛋白水平的显著上调。我们在HeLa细胞中加入DNA甲基化抑制剂脱氧胞嘧啶的类似物5-aza-deoxycytidine (5-aza-dC)(常用来诱导基因表达和诱导细胞分化)后,IGFBP3的表达被诱导；但是,干扰CUL4B的细胞中,5-aza-dC处理并不明显改变IGFBP3的表达,这说明在宫颈癌细胞中CUL4B参与DNA甲基化介导的IGFBP3的转录沉默,也支持了CRL4B复合物和SUV39H1/HP1/DNMT3A在功能上的相关性。7、在干扰CUL4B的HeLa细胞中,通过qChIP实验显示干扰CUL4B会导致DDB1, ROC1, SUV39H1, HP1α, HP1β和DNMT3A在IGFBP3启动子上的结合水平降低。同时在IGFBP3启动子上H2AK119ub1, H3K9me2, H3K9me3和5-mC的水平也有显著的下降。说明CUL4B是SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物发挥作用的重要催化亚基。第三部分CUL4B在宫颈癌发生中的作用已有研究表明IGFBP3是一个抑癌基因,它的主要生物学功能是抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和抑制细胞转移。以上研究表明CUL4B可以使IGFBP3的启动子发生甲基化并且抑制IGFBP3的转录,因此本部分将分析CUL4B是否通过对IGFBP3的调控从而促进宫颈癌的发生和发展。取得了如下结果：1、与对照HeLa细胞相比,在HeLa细胞中稳定干扰CUL4B导致细胞生长抑制,然而同时干扰CUL4B和IGFBP3可以缓解由于CUL4B抑制而引起的生长抑制。2、克隆形成实验证实干扰CUL4B明显减少克隆数目,但同时干扰CUL4B和IGFBP3可以使由于CUL4B抑制引起的克隆形成减少得以部分恢复。3.TUNEL实验检测细胞凋亡表明在CUL4B干扰组有25.82%的细胞发生凋亡,而对照组只有1.42%的细胞发生凋亡,而同时干扰CUL4B和IGFBP3则凋亡表型得到了部分拯救(凋亡细胞数从25.82%降到了11.21%)。4、软琼脂克隆形成实验表明干扰CUL4B显著减少克隆的大小和数目,说明CUL4B在不依赖支持物生长中发挥作用,预示了CUL4B可能与肿瘤细胞的恶性程度相关。另外,转移小室实验结果显示当干扰CUL4B后迁移的细胞数目与对照细胞相比有10倍的减少,但同时干扰CUL4B和IGFBP3会部分拯救由于CUL4B抑制引起的细胞转移能力下降。说明抑制CUL4B表达导致肿瘤细胞转移能力降低至少部分是由于其负调控IGFBP3所致。5、我们收集了64例宫颈癌组织标本,其中有30例成对的癌与癌旁组织,对这些标本进行了免疫组化染色。结果显示CUL4B在宫颈癌组织中显著高表达,并且其表达水平与组织分级呈显著正相关,同时CUL4B的表达与IGFBP3的表达呈显著负相关。综上所述,我们发现CRL4B可以与SUV39H1, HP1和DNMTs相互作用。CRL4B通过催化H2AK119的单泛素化继而催化H3K9的三甲基化和DNA的甲基化。我们发现CUL4B可以通过抑制IGFPB3从而促进细胞增殖、迁移和肿瘤的发生。宫颈癌组织样本分析发现CUL4B显著高表达,同时与IGFPB3的表达水平呈显著负相关。这些结果有助于深入理解CUL4B在表观遗传调控和肿瘤发生中的作用及其作用机制。

全文目录

中文摘要  6-12
ABSTRACT  12-19
符号说明  19-20
前言  20-24
第一部分 CUL4B相互作用蛋白的鉴定  24-54
  材料和方法  26-45
  结果  45-52
  讨论  52-54
第二部分鉴定CRL4B/SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物调控的靶基因  54-73
  材料和方法  55-61
  结果  61-71
  讨论  71-73
第三部分 CUL4B在宫颈癌发生中的作用  73-93
  材料和方法  74-81
  结果  81-91
  讨论  91-93
结论  93-95
参考文献  95-105
致谢  105-106
文献综述  106-119
  参考文献  114-119
博士期间发表的论文  119-120
英文论文  120-193
附件  193

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