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模拟微重力效应对BUB1/MAD2沉默后人骨肉瘤细胞CIN的影响

作　者: 刁岩
导　师: 魏力军
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 生物学
关键词: 模拟微重力人骨肉瘤细胞 RNAi BUB1 MAD2
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

染色体不稳定性（Chromosomal Instability，CIN）具体表现为染色体数目的改变和染色体结构的改变。课题组前期的研究中发现，随着人骨肉瘤细胞（U-2OS）在模拟微重力环境中生长时间逐渐延长，U-2OS细胞多极纺锤体发生率逐渐升高且细胞周期被阻滞在G2/M期，BUB1蛋白与MAD2蛋白的表达量也随之升高。为了进步研究模拟微重力效应对U-2OS细胞染色体不稳定性影响的分子机制，本课题首先利用RNA干扰技术以pSilencer4.1-CMV neo为载体构建出2个pSilencer4.1-CMV neo BUB1siRNA重组体。随后，将此重组体和课题组前期构建的pSilencer4.1-CMV neo MAD2siRNA重组体以及作为对照的乱序重组体分别转染入U-2OS细胞中筛选出对照组U-2OS细胞单克隆3个，U-2OS BUB1RNAi细胞单克隆4个，U-2OS MAD2RNAi细胞单克隆7个用于后续验当中。最后，将细胞置于模拟微重力系统中分别培养24小时、48小时和72小时后，对其多极纺锤体发生率、细胞周期以及DNA含量进行分析。研究结果表明，随着对照组U-2OS细胞在模拟微重力系统中培养时间的延长，其多极纺锤体发生率逐渐升高，而在相同环境中生长的BUB1/MAD2沉默后的U-2OS细胞，其多极纺锤体发生率逐渐下降。并且模拟微重力效应仍可将BUB1或MAD2蛋白被沉默后的U-2OS细胞阻滞在G2/M期，但是阻滞效果随模拟微重力时间的延长而降低。另外随着模拟微重力效应对BUB1或MAD2沉默后的U-2OS细胞作用时间的延长其DNA含量改变愈加明显。上述结果证明：BUB1和MAD2表达量的降低使模拟微重力效应下U-2OS细胞的染色体不稳定性增强。以上研究结果为进步探索模拟微重力效应对细胞染色体不稳定性影响的机制奠定了定的基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章绪论  8-24
  1.1 课题背景及研究的目的和意义  8-9
  1.2 空间生命科学的研究进程  9-12
    1.2.1 空间生物学的研究进程  9-10
    1.2.2 航天医学的研究进程  10-12
  1.3 微重力对细胞的生物学效应  12-14
  1.4 纺锤体组装检验点及其检验点蛋白 BUB1 与 MAD2 概述  14-18
    1.4.1 纺锤体组装检验点概述  14-16
    1.4.2 纺锤体检验点蛋白 BUB1 概述  16
    1.4.3 纺锤体检验点蛋白 MAD2 概述  16-18
  1.5 染色体不稳定性概述  18-19
  1.6 RNA 干扰技术的研究现状  19-22
    1.6.1 RNA 干扰的作用机制及其特点  19-22
    1.6.2 RNA 干扰应用概述  22
  1.7 课题的研究内容以及技术路线  22-24
第2章实验材料和方法  24-29
  2.1 实验材料  24
    2.1.1 菌株和细胞系  24
    2.1.2 菌株培养与细胞培养用品以及相关的试剂  24
    2.1.3 载体  24
  2.2 实验方法  24-28
    2.2.1 构建 siRNA-pSilencer 4.1-CMV neo vectors 表达载体  24-26
    2.2.2 细胞转染及筛选稳定转染细胞  26-27
    2.2.3 模拟微重力效应  27
    2.2.4 流式细胞术对细胞周期及 DNA 含量的检测  27
    2.2.5 免疫荧光对纺锤体变化的检测  27-28
  2.3 本章小结  28-29
第3章 BUB1/MAD2 稳定沉默 U-2 OS 细胞的建立  29-36
  3.1 PSILENCER 4.1 系列重组体的构建  29-31
    3.1.1 BUB1 基因的 siRNA 设计与制备  29-30
    3.1.2 pSilencer 4.1 与 RNA 干扰片段连接、转化  30-31
  3.2 SIRNAS 重组体的测序验证  31
  3.3 BUB1 SIRNAS 的沉默效果检验  31-32
  3.4 MAD2 SIRNAS 的沉默效果检验  32-34
  3.5 讨论  34-35
  3.6 本章小结  35-36
第4章模拟微重力效应对BUB1/MAD2沉默后U-2OS细胞多极纺锤体发生率的影响  36-42
  4.1 模拟微重力效应对BUB1 沉默后的U-2 OS 细胞多极纺锤体发生率的影响  36-38
  4.2 模拟微重力效应对MAD2 沉默后的U-2 OS 细胞多极纺锤体发生率的影响  38-40
  4.3 讨论  40-41
  4.4 本章小结  41-42
第5章模拟微重力效应对BUB1/MAD2沉默后U-2OS细胞DNA含量及细胞周期的影响  42-52
  5.1 模拟微重力效应对BUB1 稳定沉默后的U-2 OS 细胞DNA 含量与细胞周期的影响  42-46
    5.1.1 模拟微重力效应对BUB1 稳定沉默后的U-2 OS 细胞DNA 含量的影响  42-44
    5.1.2 模拟微重力效应对BUB1 稳定沉默后的U-2 OS 细胞细胞周期的影响  44-46
  5.2 模拟微重力效应对MAD2 稳定沉默后的U-2 OS 细胞DNA 含量与细胞周期的影响  46-50
    5.2.1 模拟微重力效应对MAD2 稳定沉默后的U-2 OS 细胞DNA 含量的影响  47-48
    5.2.2 模拟微重力效应对MAD2 稳定沉默后的U-2 OS 细胞细胞周期的影响  48-50
  5.3 讨论  50
  5.4 本章小结  50-52
结论  52
展望  52-54
参考文献  54-60
附录 I  60-61
附录 II  61-64
附录 III  64-67
附录 IV  67-70
致谢  70

模拟微重力效应对BUB1/MAD2沉默后人骨肉瘤细胞CIN的影响

内容摘要

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