学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

IKKα/β-shRNA真核表达载体的构建及稳定低表达IKKβ HUVECs系的建立

作　者: 刘丽丽
导　师: 黄起壬
学　校: 南昌大学
专　业: 药理学
关键词: IKKα/β 胰岛素抵抗 RNAi shRNA 稳定表达
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 11次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的：利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,构建针对IKKα/β基因的短发夹环状小干扰RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体,并将重组载体pGPU6/GFP/Neo-IKKp-shRNA2稳定转染到人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)并进行表达,建立稳定低表达IKKP内皮细胞系,为进一步研究IKKα/β基因功能与血管内皮胰岛素抵抗相互关系奠定基础。方法：利用GenBank数据库检索IKKα、IKKβ基因的核苷酸序列,根据shRNA设计原则,各自设计并合成4段特异性的小干扰片段,将其定向克隆到载体pGPU6/GFP/Neo中构建RNA干扰重组载体,并对重组载体进行酶切和测序鉴定。通过阳离子脂质体介导重组载体转染HUVECs后,采用Western blot法筛选出沉默效率最高的重组载体,同时利用G418抗性筛选,获取阳性稳定转染细胞株,并用Western blot法进行鉴定。结果：经酶切鉴定和测序分析证实,靶向IKKα和IKKβ基因的8个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体构建成功,分别命名为pGPU6/GFP/Neo-IKKα-shRNA1,2,3,4和pGPU6/GFP/Neo-IKKβ-shRNA1,2,3,4; Western blot结果显示HUVECs用高糖培养48h后,IKKα和IKKβ蛋白表达水平升高,与Control组相比具有显著性差异(P<0.01)；HUVECs分别转入IKKα-shRNA4和IKKβ-shRNA2干扰质粒,再用高糖培养48h后,IKKα和IKKβ蛋白水平明显下降,与高糖组比较具有显著性差异(P<0.01)。转染pGPU6/GFP/Neo-IKKβ-shRNA2的细胞经G418抗性筛选后,得到生长良好的单细胞克隆,Western blot结果显示pGPU6/GFP/Neo-IKKβ-shRNA2转染的G418抗性内皮细胞中IKKβ蛋白表达量明显下降,与Control组相比具有显著性差异(P<0.01)。结论：成功构建了针对IKKα和IKKβ基因的shRNA真核表达载体,并建立了稳定低表达IKKβ基因的HUVECs系,为下一步研究IKKα和IKKβ基因功能奠定了良好的实验基础。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
英文缩写及全称和中文对照表  7-9
第一章引言  9-11
第二章材料与方法  11-23
  2.1 主要材料及试剂  11-12
  2.2 实验主要仪器和设备  12-13
  2.3 主要试剂的配制  13-14
  2.4 方法  14-22
    2.4.1 靶向IKKα、IKKβ基因shRNA序列的设计合成  14-16
    2.4.2 靶向IKKα、IKKβ基因重组载体的构建和鉴定  16-19
      2.4.2.1 引物退火  16
      2.4.2.2 酶切和连接  16-17
      2.4.2.3 连接产物转化TOP10感受态细胞  17
      2.4.2.4 重组质粒的鉴定  17-18
      2.4.2.5 重组质粒的提取  18
      2.4.2.6 重组质粒的酶切鉴定  18-19
      2.4.2.7 测序鉴定  19
    2.4.3 转染重组质粒对HUVECs中IKKα/β表达的影响  19-21
      2.4.3.1 HUVECs的培养  19
      2.4.3.2 重组质粒转染HUVECs  19-20
      2.4.3.3 Western blot法检测HUVECs IKKα/β蛋白的表达  20-21
    2.4.4 IKKβ基因稳定表达细胞系的建立  21-22
      2.4.4.1 G418最佳筛选浓度的确定  21-22
      2.4.4.2 稳定转染  22
      2.4.4.3 稳定表达细胞系的鉴定  22
  2.5 数据处理  22-23
第三章结果  23-29
  3.1 重组质粒酶切鉴定  23
  3.2 重组质粒测序鉴定  23-24
  3.3 细胞转染效率的检测  24-25
  3.4 shRNA对HUVECs中IKKα/β蛋白表达的影响  25-27
  3.5 稳定表达细胞系的筛选  27
  3.6 稳定表达细胞系的鉴定  27-29
第四章讨论  29-33
第五章结论  33-34
参考文献  34-37
致谢  37-38
综述  38-43
  参考文献  41-43
攻读学位期间的研究成果  43

IKKα/β-shRNA真核表达载体的构建及稳定低表达IKKβ HUVECs系的建立

内容摘要

全文目录

相似论文