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δEF1调控乳腺癌细胞增殖和骨转移的功能研究

作　者: 胡芬
导　师: 朱天慧
学　校: 南开大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: δEF1 p21 CDK 细胞周期乳腺癌增殖 MMP-1 骨转移
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

第一部分：δEF1在乳腺癌细胞增殖中的功能研究乳腺癌是女性最常见的多发恶性肿瘤之一，无限增殖是几乎所有肿瘤细胞的特征之一，乳腺癌也毫不例外，乳腺癌细胞的异常增殖以及随后发生的转移过程所涉及的生物学过程及其原理尚不很清楚，这严重影响了乳腺癌的预防和治疗进展。 δEF1(δ-crystallinenhancer-binding factor1)隶属于一类锌指结构的转录因子超家族，具有广泛的转录抑制功能。该转录抑制功能主要依靠其两端的锌指结构簇与被调控基因的上游启动子中E2-box的结合而实现。虽然已知δEF1是癌细胞增殖和分化的一个重要的调节因子，但是关于它在调控细胞周期进程中的潜在功能还不是很清楚。我们用CCK-8试剂盒和Brdu参入流式细胞仪检测的方法研究δEF1在乳腺癌细胞周期中的作用。CCK-8实验结果表明，在MDA-MB-231细胞中过表达δEF1蛋白，可以明显促进细胞数目的增多；敲除掉内源的δEF1，则反之。BrdU处理并用流式细胞仪检测，结果证实在MDA-MB-231细胞中，δEF1的过表达可以非常明显使细胞周期处于S期的细胞的数目增加；用RNA干扰技术敲除掉δEF1，则可以得到相反的效果，这就说明δEF1可以促进乳腺癌细胞G1-S期的转换。在初步证实了δEF1可以促进乳腺癌细胞从G1向S期的转化的情况下，我们进一步对其分子机制进行了研究：在MDA-MB-231细胞中过表达δEF1，无论在转录水平还是翻译水平，均可看到CDK2和CDK4表达量的增加，p21表达量得减少。如果敲除掉内源性的δEF1，则CDK2和CDK4的表达量明显减少，p21的表达量明显被上调。这就证实在MDA-MB-231细胞中δEF1可以下调p21的表达，同时可以上调CDK2和CDK4的表达。为了进一步分析δEF1在转录水平是怎样调控p21的表达，首先，我们构建了一系列不同截短长度的人p21启动子的荧光素酶报告载体，并用网上的在线工具TRANSFAC和TESS，对人p21启动子进行了分析，结果发现在人p21启动子545/540处存在一个E2-box(CAGGTG)。荧光素酶实验和CHIP实验均证实δEF1通过结合到p21启动子的E2-box上，从而抑制p21的转录。我们又在雌激素受体ER阴性的MDA-MB-231，ER阳性的MCF-7、ZR-75-1、T47-D四种人乳腺癌细胞中用实时定量PCR和western blot方法检测到δEF1和p21表达呈明显的负相关。进一步在22例人乳腺癌组织临床标本中，实时定量PCR也检测δEF1和p21表达呈负相关。这都支持δEF1通过调控p21的表达从而调控乳腺癌细胞周期进程。综上所述，在乳腺癌细胞中，δEF1通过下调p21的表达，同时上调CDK2和CDK4的表达双重机制促进MDA-MB-231细胞的增殖。δEF1对细胞周期调控方面的研究，必将为我们如何防治乳腺癌提供一些新的思路。第二部分：δEF1在乳腺癌细胞骨转移中的功能研究在乳腺癌转移的很多阶段中，上皮细胞向间充质细胞的转化EMT是癌细胞扩散机制的基础，δEF1是含有锌指结构域的转录因子超家族的成员，在乳腺癌EMT和骨重建中起着重要的作用。我们发现δEF1在具有高迁移倾向的MDA-MB-231细胞中表达量较高，在具有低迁移倾向的MCF-7、T47-D和ZR-75-1细胞中表达量较低，并且在MDA-MB-231中过表达δEF1可以促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，而敲除掉内源性的δEF1的表达，则乳腺癌细胞的迁移和侵袭会受到抑制。骨是乳腺癌发生转移的主要靶器官之一，乳腺癌骨转移的发生往往伴随着成骨细胞和破骨细胞功能的紊乱。因此我们研究了MDA-MB-231细胞中δEF1表达的变化对乳腺癌诱导的破骨细胞成熟，成骨细胞成熟和钙沉积的影响。结果表明，过表达δEF1的MDA-MB-231细胞条件培养基不仅具有较高的诱导RAW264.7细胞TRACP活性的能力，进而促进破骨细胞的分化；而且可以抑制BMP-2诱导的C2C12细胞ALP活性的升高，以及抑制BMP-2诱导的C2C12细胞中osterix和骨钙素的表达增加，从而抑制成骨细胞的成熟；还可以减少MC3T3-E1细胞被茜素红染色的细胞数从而抑制成骨细胞的钙沉积。这就证实用过表达δEF1的MDA-MB-231中收集的条件培养基可以明显的诱导破骨细胞的成熟，并且同时抑制成骨细胞的分化和矿化；另一方面，敲除δEF1表达的MDA-MB-231细胞的条件培养基则表现出相反的作用。为了探索δEF1在乳腺癌骨转移中的具体分子机制，我们检测发现在MDA-MB-231细胞中，δEF1从转录和翻译两个水平都可以显著的上调基质金属蛋白酶-1MMP-1的表达。用转录因子数据库TESS分析MMP-1的启动子，发现在70/60的位置存在了一个AP-1位点(CATGAGTCAG)，荧光素酶实验结果显示，TPA可以上调MMP-1启动子的活性，而姜黄素(Curcumin)可以抑制MMP-1启动子的活性。而TPA，Curcumin和δEF1对人MMP-1启动子突变后的AP-1元件完全没有任何作用响应。ChIP实验证实过表达δEF1可以明显的使内源性的MMP-1启动子募集到更多的AP-1成员c-Jun/c-Fos。荧光素酶实验和CHIP实验结果都证实δEF1通过MMP-1启动子上的AP-1应答元件激活其启动子的活性。AP-1的组成元件已被证明是MAPK信号通路的下游分子，Western blot实验证实δEF1可以显著激活MDA-MB-231细胞中JNK信号通路，并且荧光素酶实验表明特异性JNK信号通路抑制剂sp600125大大削弱δEF1对MMP-1表达的诱导。可见δEF1诱导MMP-1表达这个过程是通过MAPK信号通路进行。总而言之，这些结果表明δEF1通过调节肿瘤微环境中生长因子来促进乳腺癌的骨转移过程中发挥着重要的作用。

全文目录

中文摘要  5-11
Abstract  11-24
第一部分 δEF1 在乳腺癌细胞增殖中的功能研究  24-135
  第一章引言  24-39
    第一节细胞周期调控和乳腺癌的发生发展的关系  25-35
    第二节 δEF1 分子生物学特性及其在细胞周期中的潜在作用  35-39
  第二章实验仪器与材料  39-49
    第一节主要实验仪器  39-40
    第二节实验材料  40-49
  第三章 δEF1 促进 MDA-MB-231 细胞 G1/S 转换  49-75
    第一节实验方法  49-66
    第二节实验结果  66-73
    第三节小结  73-75
  第四章 δEF1 促进乳腺癌细胞周期进程的分子机制研究  75-116
    第一节实验方法  75-100
    第二节实验结果  100-114
    第三节小结  114-116
  第五章乳腺癌细胞及组织中δEF1 和 p21 表达相关性的研究  116-128
    第一节实验方法  116-123
    第二节实验结果  123-127
    第三节小结  127-128
  第六章讨论  128-135
第二部分 δEF1 调控乳腺癌骨转移的功能研究  135-226
  第一章引言  135-144
  第二章实验仪器与材料  144-154
    第一节主要实验仪器  144-145
    第二节实验材料  145-154
  第三章 δEF1 在乳腺癌细胞系中表达情况及其在细胞迁移中作用研究  154-161
    第一节实验方法  154-156
    第二节实验结果  156-160
    第三节小结  160-161
  第四章 δEF1 的表达在 MDA-MB-231 介导的骨转移中的作用  161-180
    第一节实验方法  163-171
    第二节实验结果  171-178
    第三节小结  178-180
  第五章 δEF1 促进 MDA-MB-231 骨转移中的分子机制研究  180-217
    第一节实验方法  180-204
    第二节实验结果  204-215
    第三节小结  215-217
  第六章讨论  217-224
  第七章结论与展望  224-226
参考文献  226-249
致谢  249-251
个人简历  251-252
在学期间发表的学术论文和研究成果  252-254

δEF1调控乳腺癌细胞增殖和骨转移的功能研究

内容摘要

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