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TWIST抑制雌激素受体α表达的表观遗传分子机制及乳腺癌临床意义

作　者: 张连美
导　师: 傅俊江
学　校: 泸州医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: TWIST ERα NuRD复合物表观遗传学基因抑制乳腺癌
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的:探讨与肿瘤转移相关的重要转录因子TWIST与雌激素受体α(ERα)之间分子水平和功能上的调控关系及乳腺癌临床意义。方法:首先，构建了pcDNA5-TWIST稳定表达细胞系；其次，为了鉴定出人类基因组中潜在的TWIST结合位点，我们用HEK293-TWIST细胞系和阴性对照的HEK293细胞系来进行ChIP测序分析；然后，为了检验表达HEK293-TWIST的细胞中NuRD复合物的各组分是否也被募集到ESR1基因上的TWIST结合部位，我们相继作了ChIP和ChIP-re-ChIP实验分析；再次，为了确定乳腺癌细胞系中TWIST与ERα的表达关系，我们通过RT-PCR和Western blot方法，分析检测了5个不同类型的乳腺癌细胞系中ESR1(ERα基因)的mRNA和蛋白质水平；还有，为了检测ESR1基因上与TWIST/NuRD的相关区域是否具有抑制ESR1基因转录的功能，我们完成了如下实验：1、我们完成了荧光素报告基因分析技术；2、为了检测外源性TWIST的表达是否抑制内源性ERα的表达，我们在乳腺癌细胞中做了TWIST的RNA干扰技术和细胞转染过表达技术，使TWIST基因沉默和过表达进行分析；最后，为了检测人类乳腺癌患者中TWIST与ERα表达的关系及可能的临床意义，我们收集了28例乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤组织，抽提mRNA用半定量RT-PCR和用免疫组织化学方法检测了TWIST和ERα的mRNA和蛋白质水平。结果：建立了HEK293-TWIST细胞系及其阴性对照的HEK293细胞系；应用该细胞系，进行ChIP测序分析，发现了一个位于人类ERα基因（ESR1）内含子7上的与TWIST结合的关键DNA区域；再通过ChIP-re-ChIP实验，揭示了HEK293-TWIST细胞系中的ESR1基因上的TWIST结合位点上与TWIST结合的NuRD复合物重要组分Mi-2， MTA2和HDAC2均结合到人类ERα基因（ESR1）内含子7上的关键DNA区域。这说明了TWIST可以有效地将NuRD复合物募集到ESR1基因上的TWIST结合区域；在高侵袭性的ERα表达阴性的SUM1315、MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞系中，用RT-PCR和Western blot检测出高水平的TWIST mRNA和蛋白质表达，而在低侵袭性且高表达ERα的T47D和MCF-7细胞系中没有检测出TWIST的mRNA和蛋白质水平。在荧光素报告基因分析实验中，我们将TWIST结合的关键DNA区域克隆到pGL3-Pro-Luc报告基因上而构建成pGL3-332ESR1-Pro-Luc报告基因，再将pGL3-332ESR1-Pro-Luc报告基因质粒和TWIST表达载体共转染入HEK293细胞，结果发现过表达的TWIST显著地抑制了这个报告基因的活性，而对照组将pGL3-Pro-Luc和TWIST共转染的细胞中，TWIST的过表达并没有抑制对照组中pGL3-Pro-Luc这个报告基因的荧光素酶活性。显示ESR1基因上的TWIST/NuRD的相关区域具有转录抑制功能；在TWIST的RNA干扰和细胞转染过表达中，我们的分析揭示了在MDA-MB-435和4T1细胞系中使TWIST基因沉默，ERα的mRNA表达提高了2.5-3倍；在T47D细胞系中过表达TWIST，抑制了ERα的mRNA的表达；在MCF-7细胞系中过表达TWIST，降低了细胞中的ERα的蛋白表达水平，说明TWIST能抑制ERα的表达；HDAC抑制剂—TSA，或者基因沉默TWIST均能够解除TWIST的抑制作用。最后，我们收集28例侵袭性乳腺癌组织进行RT-PCR和免疫组化实验，发现有17位(61%)肿瘤患者具有TWIST的mRNA与蛋白高水平的表达而ERα的mRNA和蛋白低水平表达或无法检测到，7位(25%)肿瘤患者具有TWIST的mRNA和蛋白质低水平表达或者无法检测到而ERα的mRNA和蛋白质呈现高水平表达，2位(7%)肿瘤患者中TWIST和ERα的mRNA，蛋白质水平都增高，另2位(7%)肿瘤患者TWIST和ERα的mRNA，蛋白质水平都降低。这些结果显示在86%的侵袭性乳腺癌中，TWIST的表达与ERα表达呈负相关。结论：揭示了TWIST表观遗传学抑制ERα表达的分子机制；在TWIST表达阳性的乳腺癌细胞中，TWIST通过招募NuRD复合物，从而抑制了ERα的表达；TWIST表达与ERα的蛋白表达呈负相关； ERα在乳腺癌细胞中的表达和抑制是一个可逆的过程。在这些ERα表达被抑制的乳腺癌细胞中我们使用HDAC抑制剂—TSA，或者基因沉默TWIST而重新恢复ERα表达，可望在临床上治疗乳腺癌患者时，可能恢复乳腺癌细胞对激素治疗的敏感性，因而TWIST有望成为乳腺癌治疗的新靶标新策略。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
前言  11-15
材料与方法  15-29
结果  29-44
讨论  44-48
结论  48-49
参考文献  49-54
英汉缩略词对照表  54-56
综述  56-70
  参考文献  66-70
附1 彩图  70-72
附2 研究生期间发表论文  72-73
基金资助  73-74
致谢  74-75

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