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天然产物银线草醇对哺乳动物细胞糖脂代谢的调控作用研究

作　者: 胡荣宽
导　师: 吴家睿
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 银线草醇 糖脂代谢 AMPK AMP/ATP 线粒体膜电位 线粒体呼吸链
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


糖脂代谢紊乱是Ⅱ型糖尿病以及心血管疾病等代谢性疾病发生的重要原因之一。目前临床上用于治疗Ⅱ型糖尿病的药物主要有磺酰脲类化合物(sulphonylurea, SU),双胍类,噻唑烷二酮类(thiozolidinediones, TZDs),而降脂药则主要是他汀类和烟酸类。这几类药物中大多都具有激活AMPK (AMP-activated protein kinase)的功能,如二甲双胍,噻唑烷二酮等。AMPK在生物体内扮演着能量代谢枢纽的角色,AMPK被磷酸化激活后可以调节机体内的糖脂代谢,维持机体内能量的稳态。因此,研究这类化合物不单有助于新药物的研发,也有利于我们探索糖脂代谢过程中的分子调控机理。我们在本论文中,系统地研究了从金栗兰科属植物——银线草中分离的倍半萜类化合物银线草醇D (shizukaol D)和银线草醇F (shizukaol F)调控哺乳动物细胞代谢的功能和潜在的分子调控机制。论文的第一部分工作是银线草醇D调节肝细胞脂代谢的研究。实验结果表明：银线草醇D对HepG2细胞系的处理能够降低HepG2细胞内的甘油三酯和胆固醇水平。进一步的实验发现,银线草醇D对HepG2细胞的脂肪含量的调控作用依赖于AMPK-ACC信号通路。首先,银线草醇D导致HepG2细胞的AMPK磷酸化,使得AMPK活性增加,进而引起其下游蛋白-乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA catboxylase, ACC) Ser79位的磷酸化。ACC是脂肪酸合成的关键调控酶,被磷酸化后其活性降低,从而减少乙酰辅酶A到脂酰辅酶A的转化,导致了脂肪酸的合成减少；其次,当我们用siRNA或者AMPK专一抑制剂compoundC抑制AMPK活性时,银线草醇D对HepG2细胞脂肪含量的调控作用会被抑制甚至完全消失。进一步研究表明,银线草醇D引起了线粒体功能的紊乱,包括线粒体膜电位的去极化和细胞内ATP生成的抑制。后者可能是AMPK被磷酸化的直接原因。第二部分工作是银线草醇F调控哺乳动物细胞糖代谢的研究。我们的研究表明,银线草醇F能够促进L6细胞内的GLUT4在细胞膜上的定位,而且还增加了AMPK的磷酸化。在分离的原代肝细胞内,银线草醇F抑制了细胞的糖异生水平,并抑制了调节糖异生的蛋白表达。此外,丙酮酸耐受实验表明,银线草醇F可以抑制C57B/6J小鼠体内的糖异生,并且引起了肝脏中AMPK的磷酸化激活。类似于银线草醇D,银线草醇F也导致了线粒体膜电位的去极化,并且引起了细胞能量的缺失；但不同于银线草醇D,后者更类似于罗格列酮(rosiglitazone)和二甲双胍(metformin),它抑制了电子传递链复合体Ⅰ的活性,导致细胞内ATP水平的下降,引起了AMPK的磷酸化激活。综上所述,我们从银线草中筛选出两种天然化合物,能够在哺乳动物细胞内引起了AMPK的磷酸化激活,并进一步调节机体的糖脂代谢。此外,我们揭示了这两种天然产物诱导AMPK磷酸化的潜在机制。我们的研究发现,通过银线草醇诱导的AMPK磷酸化激活像一条纽带连接了线粒体功能和糖脂代谢,为寻找代谢类药物的筛选提供一定的依据和帮助。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第1章 绪论  13-41
  1.1 化学生物学  13-16
    1.1.1 化学生物学概述  13-14
    1.1.2 化学生物学的研究方法  14-16
    1.1.3 化学遗传学的应用前景  16
  1.2 银线草  16-17
    1.2.1 银线草概述  17
    1.2.2 银线草成分和已知生物学功能  17
  1.3 糖代谢网络及其调控  17-27
    1.3.1 葡萄糖摄取和GLUT4上膜  17-20
    1.3.2 葡萄糖的氧化分解  20-22
    1.3.3 葡萄糖异生  22-24
    1.3.4 糖原的合成与分解  24-26
    1.3.5 AMPK和糖代谢的调控  26-27
  1.4 脂代谢网络及其调控  27-31
    1.4.1 脂的种类  27-28
    1.4.2 脂肪酸的合成  28-29
    1.4.3 脂肪酸的氧化分解  29-30
    1.4.4 AMPK与脂代谢网络的调控  30-31
  1.5 能量代谢网络及其调控  31-36
    1.5.1 高能化合物  31-32
    1.5.2 线粒体结构及其膜电位  32-33
    1.5.3 电子传递链和氧化磷酸化  33-35
    1.5.4 AMPK与能量代谢的调控  35-36
  1.6 糖脂代谢异常与代谢疾病  36-41
    1.6.1 糖脂代谢异常与糖尿病  36-38
    1.6.2 糖脂代谢异常与心血管疾病  38-41
第2章 银线草醇D调控肝细胞脂代谢的研究  41-65
  2.1 实验材料  41-45
    2.1.1 细胞株  41
    2.1.2 化学试剂  41-45
  2.2 实验方法  45-49
    2.2.1 银线草醇D的提取和纯化  45
    2.2.2 HepG2细胞的培养  45
    2.2.3 MTT细胞毒性检测  45-46
    2.2.4 细胞甘油三酯和胆固醇的检测  46
    2.2.5 siRNA转染  46
    2.2.6 高糖诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗  46
    2.2.7 免疫共沉淀  46
    2.2.8 SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹分析  46-47
    2.2.9 线粒体膜电位检测  47
    2.2.10 细胞内腺苷酸的检测  47
    2.2.11 细胞线粒体提取及纯度检测  47-48
    2.2.12 细胞以及线粒体耗氧量的检测  48
    2.2.13 乳酸含量检测  48
    2.2.14 棕榈酸含量检测  48-49
  2.3 实验结果  49-60
    2.3.1 银线草醇D的细胞毒性的检测  49-50
    2.3.2 银线草醇D激活了肝细胞内的AMPK-ACC信号通路  50-51
    2.3.3 银线草醇D降低细胞内甘油三酯和胆固醇含量  51-53
    2.3.4 银线草醇D调控脂代谢的作用依赖于AMPK  53-55
    2.3.5 银线草醇D不影响AMPK上游—LKB1  55-56
    2.3.6 银线草醇D引起线粒体功能的紊乱  56-57
    2.3.7 银线草醇D抑制细胞的氧消耗但不影响电子呼吸链的功能  57-60
  2.4 结论与讨论  60-65
    2.4.1 银线草醇D调控肝细胞内的脂代谢  60-61
    2.4.2 银线草醇D调节脂代谢的作用依赖于AMPK  61
    2.4.3 银线草醇D激活AMPK的机制分析  61-65
第3章 银线草醇F调控糖代谢的研究  65-87
  3.1 实验材料  65-70
    3.1.1 细胞株  65
    3.1.2 实验动物  65
    3.1.3 化学试剂  65-70
  3.2 实验方法  70-75
    3.2.1 L6细胞培养和分化  70
    3.2.2 MTT细胞毒性检测  70
    3.2.3 细胞膜和细胞质组分的分离  70
    3.2.4 葡萄糖摄取检测  70-71
    3.2.5 SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹分析  71
    3.2.6 细胞免疫荧光  71
    3.2.7 小鼠原代肝细胞分离  71
    3.2.8 原代肝细胞糖异生实验  71-72
    3.2.9 糖原含量检测  72
    3.2.10 RNA提取  72
    3.2.11 逆转录PCR和实时荧光定量PCR  72
    3.2.12 小鼠肝脏组织线粒体的提取  72-73
    3.2.13 细胞以及线粒体耗氧量的检测  73
    3.2.14 细胞腺苷酸的检测  73
    3.2.15 乳酸含量检测  73
    3.2.16 线粒体膜电位检测  73
    3.2.17 小鼠灌胃和腹腔注射给药  73-74
    3.2.18 小鼠空腹血糖检测  74
    3.2.19 丙酮酸和葡萄糖耐受实验  74-75
  3.3 实验结果  75-83
    3.3.1 银线草醇F促进L6细胞葡萄糖摄取并加强葡萄糖氧化  75-77
    3.3.2 银线草醇F改变线粒体膜电位且抑制能量生产  77-78
    3.3.3 银线草醇F抑制线粒体电子呼吸链复合体Ⅰ的功能  78-79
    3.3.4 银线草醇F在原代肝细胞中的毒性检测  79-80
    3.3.5 银线草醇F抑制原代肝细胞的葡萄糖异生  80-81
    3.3.6 银线草醇F抑制小鼠的葡萄糖异生作用  81-83
  3.4 结论与讨论  83-87
    3.4.1 银线草醇F促进肌肉细胞对葡萄糖摄取  83
    3.4.2 银线草醇F通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ来激活AMPK  83-84
    3.4.3 银线草醇F抑制了葡萄糖异生  84-87
参考文献  87-109
附录  109-110
致谢  110-112
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  112

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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