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小檗碱对心肌肥厚及纤维化的作用及其机制研究

作　者: 程阔菊
导　师: 王晖；李红良
学　校: 广东药学院
专　业: 中药学
关键词: Berberine 心肌肥厚 纤维化 AMPK
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景:心肌肥厚与纤维化是心脏长期负荷过重时发生的一种心室重构,除心肌细胞蛋白质合成增加和细胞体积增大外,还伴随心肌细胞间结缔组织沉积。心肌肥厚也是多种心血管系统疾病的常见并发症和病理基础,常导致严重的心律失常、心力衰竭,预防与逆转这种改变是治疗的重要目标。磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶。目前对AMPK的研究主要集中在能量代谢调节方面,且在糖尿病及肥胖症等人类代谢性疾病的发病中发挥着至关重要的作用。近年来研究发现,AMPK基因突变可导致心肌肥大及心律失常,以及AMPK的激活可通过负性调节mTOR/ p70 S6K通路减轻由压力负荷过度诱发的的心肌肥厚与纤维化。因此AMPK有望成为心肌肥厚与纤维化疾病中的治疗新靶点。小檗碱(Berberine,BBR),一种天然异喹啉类生物碱,作为清热解毒药和抗菌药应用于临床已有很长的历史。随着对小檗碱的深入研究发现,小檗碱在糖尿病、代谢性疾病、心血管疾病中具有广泛的药理作用,表现为抗动脉粥样硬化、抗Ⅱ型糖尿病、对抗肥胖症、对心脏的正向肌力作用、抗心律失常、扩张血管降压、抗心肌缺血等。大量的机制研究发现,其主要是通过激活AMPK而起作用。鉴于AMPK在心肌肥厚及纤维化中的作用,我们推测小檗碱可能通过激活AMPK抑制心肌肥厚及纤维化的发生发展。在心脏中,AMPKα2是其主要的催化亚基,我们应用AMPKα2基因敲除小鼠,拟在压力负荷过度诱发的的小鼠心肌肥厚与纤维化模型基础上,研究Berberine对心肌肥厚与纤维化的作用,同时进行体外细胞实验研究,阐明小檗碱对压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚及纤维化的作用、作用靶点及相关分子机制。希望能为小檗碱治疗心肌肥厚及纤维化提供科学的理论依据,同时为心肌肥厚与纤维化疾病的治疗提供新的治疗靶点。目的:获得Berberine抑制心肌肥厚及纤维化的可靠证据,并阐明其作用机制,为AMPK作为心肌肥厚及纤维化治疗的新靶点提供充分的科学依据,同时为Berberine作为心肌肥厚及纤维化治疗提供充分的理论研究。方法:1 Berberine对PE诱导的心肌细胞肥大作用的研究培养大鼠原代心肌细胞,用不同浓度(0, 5, 10, 20, 30μM)Berberine预处理心肌细胞60min后,用100μM PE(phenylephrine,苯肾上腺素)处理心肌细胞0, 6, 12, 24,48h。采用[3H]-亮氨酸掺入法、计算心肌细胞面积、real-time PCR检测心肌细胞肥大标志物心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide , ANP)、B型利钠肽(B-type natriuretic peptide ,BNP),评价各组心肌细胞肥大的情况,筛选最佳的用药剂量浓度及作用时间。2 Berberine对AB诱导的野生型小鼠心肌肥厚及纤维化作用的研究选取8周龄、体重24-26g雄性C57BL/6野生型小鼠,以胸主动脉缩窄诱导小鼠心肌肥厚模型。实验共分八组:Sham(假手术)组、AB(Aortic binding,主动脉缩窄术)模型组、Sham组+BBR(berberine)低中高剂量(40mg/kg、80mg/kg、100mg/kg)组、AB模型组+ BBR低中高剂量(40mg/kg、80mg/kg、100mg/kg)组,每组各20只。术后8w,超声及血流动力学评价小鼠心脏功能;HE染色观察心脏大体组织和细胞横切面积;PSR(Picrosirius red,天狼星红染色)观察心肌组织胶原;real-time PCR检测心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、肌球蛋白重链α(α-myosin heavy chain,α-MHC)、肌球蛋白重链β(β-myosin heavy chain,β-MHC),心肌纤维化标志物结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor , CTGF)、I型溶胶原α1(Procollagen, type I ,α1, CollagenI)、III型溶胶原α1(Procollagen, type III,α1, CollagenIII)的mRNA水平,评价Berberine对胸主动脉缩窄诱导小鼠心肌肥厚的作用,筛选药物的最佳作用剂量。3 Berberine抑制心肌肥厚及纤维化分子机制的探讨30μMBerberine预处理大鼠原代心肌细胞60min,用100μM PE处理心肌细胞0,48h。8周龄、体重24-26g雄性C57BL/6野生型小鼠,以胸主动脉缩窄诱导小鼠心肌肥厚模型;实验分四组:Sham(假手术)组、AB模型组、Sham组+ BBR(berberine)(100mg/kg)组、AB模型组+BBR低(100mg/kg)组,每组各20只。Wetern blot检测AMPK相关信号通路总蛋白及磷酸化蛋白的表达水平。4 Berberine对AB诱导的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纤维化作用的研究选取8周龄、体重24-26g雄性AMPKα2 Ko(knock out)小鼠,以胸主动脉缩窄诱导小鼠心肌肥厚模型。实验共分四组:Sham(假手术)组、AB模型组、Sham组+BBR(100mg/kg)组、AB模型组+ BB(100mg/kg)组,每组各20只。术后4w,超声及血流动力学评价小鼠心脏功能;HE染色观察心脏大体组织和细胞横切面积;PSR观察心肌组织胶原;real-time PCR检测心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、α-MHC、β-MHC、胆固醇酰基转移酶1(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 1, Acat1)、血管紧张素Ⅱ受体1亚型(angiotensin 2 receptor, type 1, AT1)、GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA4)、肌细胞增强因子2C (myocyte enhancer factor 2C , Mef2c)、钙神经素1调节剂(regulator of calcineurin 1, MCIP1.4、肌浆网钙ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase , SERCA2a)、血管紧张素1转换酶(angiotensin I converting enzyme , ACE)以及纤维化标志物转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGFβ1)、转化生长因子β2(transforming growth factorβ2, TGFβ2)、Collagen I、CollagenⅢ、CTGF、纤维连接素(Fibronection, FN)、基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase2, MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrixmetallopeptidase9, MMP-9)、骨桥蛋白(osteopontin , OPN)。结果:1 Berberine对PE诱导的心肌细胞肥大作用的探讨细胞实验结果表明,Berberine能够减少PE诱导后的原代大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入量的增多、心肌细胞面积的增大、心肌细胞肥大标志物ANP、BNP的升高,且成剂量依赖性,30μM时作用最为明显。表明Berberine能够抑制PE诱导的心肌细胞肥大。2 Berberine对AB诱导的野生型小鼠心肌肥厚及纤维化作用的影响超声及血流动力学结果显示,模型组中,左室舒张末期内径(Left ventricμlar end-diastolic dimension , LVEDD)、左室收缩末期内径(Left ventricμlar end-systolic dimension , LVESD)、左室后壁厚度(Left ventricμlus posterior wall dimension , LVPWd显著升高(P<0.05),而短轴缩短率(Fractional shortening , FS)显著下降(P<0.05),给予Berberine治疗后LVEDD、LVESD、LVPWd显著降低(P<0.05),而FS显著升高(P<0.05),其中高剂量组(100mg/kg)组最为显著;病理染色结果显示:模型组中,心肌细胞面积显著增大(p<0.05)、心肌组织胶原明显增多(p<0.05),给予Berberine治疗后,心肌细胞面积显著减小(p<0.05)、心肌组织胶原明显增少(p<0.05);real-timePCR检测结果显示,模型组中心肌细胞肥大标志物(ANP、BNP、α-MHC、β-MHC)、心肌纤维化标志物(CTGF、CollagenI、CollagenIII)的mRNA水平明显上升,给予Berberine治疗后,心肌细胞肥大标志物(ANP、BNP、β-MHC)、心肌纤维化标志物(CTGF、CollagenI、CollagenIII)的mRNA水平明显下降。表明berberine能显著抑制由胸主动脉诱导的心肌肥厚。3 Berberine抑制心肌肥厚及纤维化的分子机制Western blot检测结果表明,在PE诱导的大鼠心肌细胞肥大模型中及主动脉缩窄诱导的小鼠心肌肥厚模型中,AMPK、ACC、mTOR、p70S6K及eEF2的总蛋白无变化,而它们的磷酸化水平p-AMPK、p-ACC ser79、p-mTOR、p-p70S6Kthr389显著上调(P<0.05),p-eEF2thr56显著下调(P<0.05),表明在PE诱导的大鼠心肌细胞肥大模型中及主动脉缩窄诱导的小鼠心肌肥厚模型中,AMPK及mTOR/70S6K信号通路被激活;应用Berberine干预后,与模型组相比较,AMPK、ACC、mTOR、70S6K及eEF2的总蛋白无变化,磷酸化水平p-AMPK、p-ACCser79、p-eEF2 thr56显著上调(P<0.05),而p-mTOR、p-70S6K thr389显著下调(P<0.05),表明Berberine可进一步激活AMPK,负性调节mTOR/70S6K信号通路。4 Berberine对AB诱导的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纤维化作用超声及血流动力学结果显示,模型组中, LVEDD、LVESD、LVPWd显著升高(P<0.05),而FS显著下降(P<0.05),给予Berberine干预后LVEDD、LVESD、LVPWd、FS无显著变化(P>0.05);病理染色结果显示:模型组中,心肌细胞面积显著增大(p<0.05)、心肌组织胶原明显增多(p<0.05);给予Berberine干预后,心肌细胞面积、心肌组织胶原无显著改变(P>0.05);real-time PCR检测结果显示,模型组中心肌细胞肥大标志物(ANP、BNP、β-MHC、Acat1、Mcip1.4、ACE、GATA4、Mef2c)的mRNA水平显著升高(p<0.05),AT1、SERCA2a显著降低(p<0.05),以及纤维化指标(TGFβ1、TGFβ2、Collagen I、CollagenⅢ、CTGF、Fibronection、MMP-2、MMP-9、OPN)的mRNA水平显著上升(p<0.05),给予Berberine治疗后,心肌细胞肥大标志物及心肌纤维化标志物的mRNA水平均无明显变化。表明Berberine对AB诱导的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纤维化无明显作用。结论:细胞及动物实验证实,Berberine能明显改善心肌肥厚的发生发展。其改善心肌肥厚的分子机制可能是通过激活AMPKα2,进而负性调节mTOR/ p70 S6K信号通路。

全文目录


中文摘要  10-15
英文摘要  15-20
序言  20-22
第一部分 Berberine 对PE 诱导的大鼠心肌细胞肥大作用的研究  22-36
  1 前言  22
  2 实验材料  22-24
    2.1 实验细胞  22
    2.2 主要仪器及耗材  22-23
    2.3 主要试剂及溶液配制  23-24
      2.3.1 主要试剂  23
      2.3.2 主要溶液配制  23-24
  3 实验方法  24-30
    3.1 心肌细胞的分离、纯化、培养  24-25
    3.2 心肌细胞的鉴定  25-26
      3.2.1 心态学观察  25
      3.2.2 免疫荧光鉴定  25-26
    3.3 [~3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率  26
    3.4 心肌细胞面积的测定  26-27
    3.5 心肌细胞肥大分子标志物的检测  27-30
      3.5.1 心肌细胞总RNA 的提取  27
      3.5.2 RNA 反转率成cDNA  27-28
      3.5.3 Real-Time PCR 相对定量分析  28-30
  4 统计学分析  30
  5 实验结果  30-33
    5.1 心肌细胞心态学及免疫学观察  30-31
      5.1.1 心肌细胞心态学观察  30-31
      5.1.2 免疫荧光鉴定  31
    5.2 Berberine 对PE 诱导的大鼠[3H]-亮氨酸掺入量的影响  31
    5.3 Berberine 对PE 诱导的大鼠心肌细胞面积的影响  31-32
    5.4 Berberine 对PE 诱导的大鼠心肌细胞肥大分子标志物的影响  32-33
  6 结论  33
  7 讨论  33-36
    7.1 大鼠心肌细胞肥大模型的建立  33-34
    7.2 Berberine 对PE 诱导的大鼠心肌细胞肥大的作用  34-36
第二部分 Berberine 对主动脉缩窄诱导的野生型小鼠心肌肥厚及纤维化的作用研究  36-55
  1 前言  36
  2 实验材料  36-38
    2.1 实验动物  36-37
    2.2 主要仪器及耗材  37-38
    2.3 主要试剂及溶液配制  38
      2.3.1 主要试剂  38
      2.3.2 主要溶液配制  38
  3 实验方法  38-43
    3.1 动物模型的建立  38-39
      3.1.1 造模  38-39
      3.1.2 术后观察  39
    3.2 心功能检测  39-40
      3.2.1 心脏超声检测  39-40
      3.2.2 心脏血流多普勒检测  40
      3.2.3 心脏血流动力学PV 检测  40
    3.3 心脏取材及HW/BW、LW/BW 测定  40
    3.4 病理学检测  40-42
      3.4.1 心脏脱水、石蜡包埋、切片  40-41
      3.4.2 HE 染色步骤  41
      3.4.3 WGA 染色步骤  41-42
      3.4.4 天狼猩红染色步骤  42
    3.5 心肌肥厚及纤维化分子标志物检测  42-43
      3.5.1 组织样本RNA 的提取  42-43
      3.5.2 RNA 反转成cDNA  43
      3.5.3 Real-Time PCR 相对定量分析  43
  4 统计学分析  43-44
  5 实验结果  44-50
    5.1 心功能检测结果  44-46
    5.2 心脏WB/BW、LW/BW 检测结果  46-47
    5.3 病理学检测结果  47-50
      5.3.1 HE 染色结果  47-48
      5.3.2 WGA 染色结果  48-49
      5.3.3 天狼星红染色结果  49-50
    5.4 心肌肥厚及纤维化分子标志物检测结果  50
  6 结论  50-51
  7 讨论  51-55
    7.1 动物模型的建立  51-52
    7.2 berberine 对AB 诱导的心肌肥厚及纤维化的影响  52-55
      7.2.1 心肌肥厚病理学基础  52-53
      7.2.2 心肌肥厚及纤维化的分子标志物  53-54
      7.2.3 berberine 对AB 诱导的心肌肥厚及纤维化的影响  54-55
第三部分 Berberine抑制心肌肥厚的分子机制探讨  55-67
  1 前言  55
  2 实验材料  55-59
    2.1 实验细胞及动物  55-56
      2.1.1 实验细胞及分组  55-56
      2.1.2 实验动物及分组  56
    2.2 主要仪器及耗材  56
    2.3 主要试剂及溶液配制  56-59
      2.3.1 主要试剂  56-57
      2.3.2 主要溶液配制  57-59
  3 实验方法  59-61
    3.1 心肌细胞的分离、纯化、培养、给药处理  59
    3.2 动物模型的建立、给药  59
    3.3 Wetern-blot 检测  59-61
  4 统计学分析  61
  5 实验结果  61-63
    5.1 细胞实验信号通路检测结果  61-62
    5.2 动物实验信号通路检测结果  62-63
  6 结论  63
  7 讨论  63-67
    7.1 病理性心肌肥厚的信号转导通路途径  63-65
      7.1.1 机械信号诱导心肌肥厚的信号转导途径  63-64
      7.1.2 神经体液因子介导的心肌肥厚信号转导途径  64
      7.1.3 蛋白激酶在心肌肥厚中的作用  64-65
    7.2 Berberine 抑制心肌肥厚的分子机制及信号转导通路  65-67
      7.2.1 AMPK 与心肌肥厚  65
      7.2.2 Berberine 的心血管药理作用  65
      7.2.3 Berberine 抑制心肌肥厚的分子机制及信号转导通路  65-67
第四部分 Berberine 对主动脉缩窄诱导的AMPKα2 Ko 小鼠心肌肥厚及纤维化的作用研究  67-85
  1 前言  67
  2 实验材料  67-69
    2.1 实验动物  67
    2.2 主要仪器及耗材  67-68
    2.3 主要试剂及溶液配制  68-69
      2.3.1 主要试剂  68
      2.3.2 主要溶液配制  68-69
  3 实验方法  69-72
    3.1 基因型鉴定  69-70
      3.1.1 剪取小鼠尾巴  69
      3.1.2 鼠尾消化  69
      3.1.3 PCR、电泳  69-70
    3.2 动物模型的建立  70
    3.3 心功能检测  70-71
      3.3.1 心脏超声检测  70-71
      3.3.2 心脏血流多普勒检测  71
      3.3.3 心脏血流动力学PV 检测  71
    3.4 心脏取材及HW/BW、LW/BW、HW/IL 测定  71
    3.5 病理学检测  71
      3.5.1 心脏脱水、石蜡包埋、切片  71
      3.5.2 HE 染色  71
      3.5.3 WGA 染色  71
      3.5.4 天狼星红染色.  71
    3.6 心肌肥厚及纤维化分子标志物检测  71-72
  4 统计学分析  72-73
  5 实验结果  73-83
    5.1 基因型鉴定结果  73
    5.2 心功能检测结果  73-77
      5.2.1 心脏超声检测结果  73-76
      5.2.2 心脏血流动力学检测结果  76-77
    5.3 心脏WB/BW、LW/BW、HW/IL 检测结果  77-78
    5.4 病理学检测结果  78-81
      5.4.1 HE 染色结果  78-79
      5.4.2 WGA 染色结果  79-80
      5.4.3 天狼星红染色结果  80-81
    5.5 心肌肥厚及纤维化分子标志物检测结果  81-83
      5.5.1 心肌肥厚分子标志物检测结果  81-82
      5.5.2 心肌纤维化分子标志物检测结果  82-83
  6 结论  83
  7 讨论  83-85
总结  85-87
讨论  87-89
参考文献  89-98
综述  98-106
  参考文献  101-106
攻读学位期间发表的论文  106-108
附录一 附图  108-109
附录二 缩写词中英文对照表  109-112
致谢  112

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