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青蟹双顺反子病毒-1快速检测方法的建立及初步应用

作　者: 张迪
导　师: 冯娟
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 拟穴青蟹青蟹双顺反子病毒-1 环介导等温扩增试验双重巢式PCR 荧光定量PCR
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国东南沿海地区重要的海水养殖品种，但是随着养殖规模的扩大，疾病不断发生，导致青蟹养殖死亡率居高不下。青蟹双顺反子病毒-1（Mud crab dicistrovirus-1，学名Mud Crab virus）是从发生大规模死亡的青蟹中分离出来的、对拟穴青蟹存在很强的致病性的病原，对青蟹养殖危害严重。快速、准确、灵敏的检测方法无论是对于该病的预防，还是对于该病的进一步深入研究都具有重要的意义。因此，本文建立了该病毒的LAMP检测方法、荧光定量PCR检测方法、以及双重巢式PCR检测方法，并将这些检测方法初步应用于MCDV-1流行和感染特点研究。首先，本研究以环介导等温核酸扩增技术(LAMP)为基础建立了MCDV-1的LAMP快速检测方法。根据GenBank中MCDV-1VP2基因序列，设计2对特异性引物，并优化了反应条件，确定了特异性和灵敏度。当外引物浓度为0.2μmol/L，内引物浓度为1.6μmol/L，Mg2+浓度为6mmol/L，dNTPs浓度为0.8mmol/L，甜菜碱浓度为0.8mol/L，62℃反应1h时，可获得最佳检测结果；通过浑浊度或加入SYBRGreen I染色液，以肉眼观察判定结果，或通过电泳结果判定。本方法可以特异性地扩增MCDV-1模板，而对鲍鱼肌肉萎缩病毒（AbSV）、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、对虾白斑综合症病毒（WSSV）、神经坏死病毒（NNV）、急性病毒性坏死症病毒（AVNV）和青蟹呼肠孤病毒（MCRV）模板的检测均为阴性。灵敏度试验表明本方法可以检测到低达6个拷贝的病毒基因，灵敏度较常规RT-PCR提高了至少1000倍。其次，本研究根据MCDV-1基因序列，选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针，通过对实时定量PCR反应条件进行优化，建立了用于检测青蟹双顺反子病毒-1的实时定量PCR方法。利用该方法检测MCDV-1及鲍鱼肌肉萎缩病毒（AbSV）、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、对虾白斑综合症病毒（WSSV）、神经坏死病毒（NNV）、急性病毒性坏死症病毒（AVNV）和青蟹呼肠孤病毒（MCRV）这7种常见水生动物病毒，结果只能检测到MCDV-1，表现了良好的特异性。该方法灵敏性高（可达8个拷贝的病毒基因）、重复性好（组内及组间实验的变异系数分别为1.11%以及1.3%）。建立的标准曲线在8.0×108~8.0copies范围内存在很好的线性关系(R2=0.992)。利用该方法对感染拟穴青蟹鳃组织不同部位MCDV-1病毒量进行比较研究。结果显示，拟穴青蟹鳃组织不同部位MCDV-1的量在1010-1011copies/g之间。不论左、右部鳃丝、上、中、下部鳃丝，或鳃丝的顶部、中部和基部，所携带的病毒量并不存在统计学上的差异。即MCDV-1在感染拟穴青蟹鳃组织后，均匀分布于鳃组织的各个部位。此外，本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物，建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR（duplex-nested PCR）检测方法。PCR产物因大小不同而得以区分。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到10个拷贝，并且与鲍鱼肌肉萎缩病毒（AbSV）、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、对虾白斑综合症病毒（WSSV）、神经坏死病毒（NNV）、急性病毒性坏死症病毒（AVNV）这6种水生动物常见病毒均无交叉反应，可以特异性地检测两种病毒。运用该方法对阳江地区2012年5-10月捕捞的野生拟穴青蟹病毒携带情况进行调查，结果显示，阳江地区2012年5-10月的野生青蟹体内一直保持着较高的病毒携带率（44.83-100%）。MCDV-1检出率最高的月份为6、8、9月，MCRV检出率最高的月份为5-6月和8-9月。故而，两种病毒的流行月份为5-6月和8-9月，流行期间野生拟穴青蟹体混合感染的比例在10-100%之间。总之，本研究建立的MCDV-1快速检测方法特异、敏感、高效、快捷，均可用于MCDV-1的临床诊断。而这三种方法各有特点，适用于不同的用途。LAMP检测方法在恒温条件下1个小时即完成反应，检测结果容易判断，在基层生产单位和野外实验条件下的MCDV-1检测具有广阔的应用前景。MCDV-1荧光定量PCR法定量准确可靠，可用于MCDV-1的病原检测和科学研究中。双重巢式PCR的建立，实现了对MCDV-1和MCRV的早期同时快速诊断，适合应用于青蟹病毒的流行病学调查研究。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
引言  11-12
第一章绪论  12-24
  1 双顺反子病毒研究概况  12-19
    1.1 分类学  12-14
    1.2 病毒粒子结构  14
    1.3 基因组结构  14-15
    1.4 编码蛋白质及其功能  15-16
    1.5 顺式作用的基因表达和复制的元素  16-17
    1.6 青蟹双顺反子病毒-1 的研究进展  17-19
  2 水产常见病毒的检测方法  19-22
    2.1 病原学检测  19-20
    2.2 免疫学检测  20
    2.3 核酸检测  20-22
  3 本研究的目的和意义  22-24
第二章青蟹双顺反子病毒-1 环介导等温扩增检测方法的建立  24-38
  1 材料与方法  24-30
    1.1 材料  24-27
    1.2 LAMP 引物设计  27
    1.3 拟穴青蟹鳃组织样品处理  27-28
    1.4 重组质粒的获得  28-29
    1.5 LAMP 反应条件的优化  29
    1.6 产物检测  29-30
    1.7 灵敏度试验  30
    1.8 特异性实验  30
    1.9 应用性试验  30
  2 结果与分析  30-36
    2.1 LAMP 反应条件的优化  30-31
    2.2 产物检测  31-33
    2.3 灵敏度试验  33-34
    2.4 特异性实验  34-35
    2.5 应用性试验  35-36
  3 讨论  36-38
第三章青蟹双顺反子病毒-1 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立  38-49
  1 材料与方法  38-43
    1.1 材料  38-39
    1.2 引物与探针的设计与合成  39-40
    1.3 总 RNA 提取及 cDNA 的合成  40
    1.4 标准品的制备  40
    1.5 Real time-PCR 反应体系的建立及优化  40
    1.6 标准曲线的绘制  40-41
    1.7 灵敏度试验  41
    1.8 特异性试验  41
    1.9 重复性和稳定性实验  41
    1.10 感染拟穴青蟹鳃组织不同部位 MCDV-1 病毒量比较研究  41-43
  2 结果与分析  43-47
    2.1 优化后的荧光定量反应体系  43
    2.2 标准曲线的绘制  43
    2.3 灵敏度试验  43-44
    2.4 特异性检测  44
    2.5 重复性和稳定性实验  44-46
    2.6 感染拟穴青蟹鳃组织不同部位 MCDV-1 病毒量比较研究  46-47
  3 讨论  47-49
第四章青蟹呼肠孤病毒和青蟹双顺反子病毒-1 的双重巢式 PCR 检测方法  49-57
  1 材料与方法  49-51
    1.1 材料  49
    1.2 引物设计  49-50
    1.3 总 RNA 提取及 cDNA 的合成  50
    1.4 PCR 反应体系  50
    1.5 双重巢式 PCR 反应条件的优化  50
    1.6 灵敏度试验  50
    1.7 特异性试验  50-51
    1.8 检测方法的应用  51
  2 结果与分析  51-55
    2.1 双重巢式 PCR 反应体系的优化  51-53
    2.2 灵敏度试验  53
    2.3 特异性试验  53-54
    2.4 检测方法的应用  54-55
  3 讨论  55-57
第五章阳江地区野生拟穴青蟹 MCRV 与 MCDV-1 流行病学调查  57-64
  1 材料与方法  57-58
    1.1 材料  57
    1.2 采样方法  57-58
    1.3 病毒检测  58
  2 结果与分析  58-61
  3 讨论  61-64
结论  64-65
参考文献  65-73
附录  73-76
致谢  76

青蟹双顺反子病毒-1快速检测方法的建立及初步应用

内容摘要

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