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一氧化氮合酶及其相关因子在凡纳滨对虾免疫反应中特性的研究

作　者: 冀培丰
导　师: 姚翠鸾
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 凡纳滨对虾一氧化氮合酶精氨酸激酶钙调蛋白免疫反应
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文检测了病原模式分子β-1,3葡聚糖（Laminarin）、脂多糖（LPS）、及RNA病毒模式分子（poly I:C）、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）和对虾白斑病毒（WSSV）刺激后凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）体内重要的免疫相关因子在转录水平的表达变化和部分重要免疫指标的变化；克隆得到了重要免疫因子一氧化氮合酶（NOS）以及与其活性调控和信号传递密切相关因子精氨酸激酶（AK）和两种亚型钙调蛋白（LvCaM-long、LvCaM-short）的全长cDNA，分析了它们的结构特性，研究了这些基因的组织表达谱及在对虾免疫反应中的表达变化，利用原核表达系统对NOS中NO合成结构域肽段、LvCaM-long、AK进行了体外表达，并研究了与AK相互作用的蛋白质。结果如下：得到了病原模式分子、副溶血弧菌和WSSV刺激后凡纳滨对虾血细胞和肝胰腺中的病原识别、酚氧化酶原激活、抗氧化酶、抗菌杀菌等系统因子的表达变化特征，在一定程度上阐释了它们在对虾免疫过程中的角色和机理。利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆得到了长度为4680bp的凡纳滨对虾NOS cDNA序列，其ORF为3540bp，编码1179个氨基酸。序列分析表明凡纳滨对虾NOS主要包含4个主要的保守结构域，即NO synthase结构域；flavodoxin1结构域；FAD结合域；NAD结合域。Real-time PCR分析发现，在转录水平上，肝胰腺中NOS表达丰度最高，其次是神经。副溶血弧菌和WSSV刺激后，血细胞和肝胰腺中NOS在mRNA水平上的表达量和酶活力都显著降低，提示NOS可能在对虾抵抗病原入侵的免疫防御中发挥了重要作用。对该基因的NO生成区进行了原核表达，并纯化出了目的蛋白，为进一步在蛋白水平上研究NOS提供了条件。凡纳滨对虾AK基因全长1446bp，编码区1071bp，编码356个氨基酸，有两个主要的结构域，分别为ATP-gua PtansN结构域和ATP-gua Ptrans结构域。对该基因进行原核表达，并得到了有活性的表达产物。Real-time PCR和Western-blot分析发现，AK在对虾肌肉、血细胞、胃、心脏和神经中均有转录和翻译。副溶血弧菌和WSSV刺激后，对虾血细胞、肝胰腺和肌肉中AK基因表达及酶活力都发生了明显变化，同时肌肉中ATP含量显著降低，说明AK及其调控的能量代谢在对虾的免疫过程起着重要作用。通过GST-pull dwon及酵母双杂交方法，发现AK与actin T2之间存在蛋白质相互作用。克隆得到了1101bp和689bp的凡纳滨对虾体内两种类型的CaM全长cDNA，LvCaM-long和LvCaM-short。LvCaM-long编码区450bp，编码149个氨基酸；LvCaM-short基因编码区510bp，可编码169个氨基酸。序列分析发现两种类型的CaM主要包含4个EF-hand钙离子结合的结构域。Real-time PCR发现LvCaM-long在神经中表达丰度最高，其次是鳃，然后是肝胰腺、肌肉、心脏、胃、血细胞和小肠。LvCaM-short在肝胰腺中表达丰度最高，其它组织表达丰度都非常低。副溶血弧菌和WSSV刺激后，两种类型的CaM基因的反应特性不相同，提示它们在免疫反应中发挥着不同的作用。对LvCaM-long基因进行原核表达，结果得到了可溶性的目的蛋白，为对CaM的深入研究奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章引言  11-21
  1.1 凡纳滨对虾概况  11
  1.2 对虾的免疫机制  11-16
    1.2.1 器官免疫  11-12
    1.2.2 细胞免疫  12-13
    1.2.3 体液免疫  13-16
  1.3 一氧化氮合酶在对虾免疫中的功能  16-20
    1.3.1 一氧化氮的生物合成及生理功能  16-17
    1.3.2 一氧化氮合酶对一氧化氮生成的调控  17-18
    1.3.3 一氧化氮合酶对一氧化氮生成中的调控作用  18-19
    1.3.4 与对虾一氧化氮合成和调控相关的其他因子  19
    1.3.5 精氨酸激酶  19
    1.3.6 钙调蛋白  19-20
  1.4 本研究的目的及意义  20-21
第2章免疫刺激后凡纳滨对虾重要免疫相关因子的表达变化  21-43
  2.1 病原模式分子刺激后重要免疫相关基因及免疫因子的变化  22-34
    2.1.1 材料  22-23
    2.1.2 实验方法  23-26
    2.1.3 结果  26-32
    2.1.4 讨论  32-34
  2.2 副溶血弧菌和 WSSV 刺激后重要免疫相关基因及免疫因子的变化  34-43
    2.2.1 材料  34
    2.2.2 实验方法  34-35
    2.2.3 结果  35-41
    2.2.4 讨论  41-43
第3章凡纳滨对虾 NOS 基因的克隆与表达  43-64
  3.1 凡纳滨对虾 NOS 基因的克隆与表达特性  43-57
    3.1.1 材料  43-46
    3.1.2 实验方法  46-49
    3.1.3 结果  49-56
    3.1.4 讨论  56-57
  3.2 凡纳滨对虾 NOS 基因部分片段的原核表达  57-64
    3.2.1 材料  57-59
    3.2.2 实验方法  59-61
    3.2.3 结果  61-63
    3.2.4 讨论  63-64
第4章凡纳滨对虾 AK 基因的克隆、表达特性、体外表达以及蛋白相互作用  64-99
  4.1 凡纳滨对虾 AK 基因的克隆、表达特性  65-79
    4.1.1 材料与方法  65-66
    4.1.2 实验方法  66-69
    4.1.3 结果  69-78
    4.1.4 讨论  78-79
  4.2 凡纳滨对虾 AK 基因的表达以及与之相互作用蛋白质的分析  79-99
    4.2.1 材料  79-80
    4.2.2 实验方法  80-90
    4.2.3 结果  90-97
    4.2.4 讨论  97-99
第5章凡纳滨对虾 CaM 基因的克隆、表达特性和体外表达  99-114
  5.1 凡纳滨对虾 CaM 基因的克隆、表达特性  99-111
    5.1.1 材料与方法  99-101
    5.1.2 实验方法  101-103
    5.1.3 结果  103-110
    5.1.4 讨论  110-111
  5.2 凡纳滨对虾 LvCaM-long 基因的原核表达  111-114
    5.2.1 材料  111
    5.2.2 实验方法  111-112
    5.2.3 结果  112-113
    5.2.4 讨论  113-114
第6章结论、实验创新及展望  114-116
  6.1 结论  114-115
  6.2 实验的创新点  115
  6.3 展望  115-116
致谢  116-117
参考文献  117-129
在学期间发表的学术论文  129

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