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拟穴青蟹过敏原的性质研究

作　者: 余惠琳
导　师: 刘光明
学　校: 集美大学
专　业: 微生物学
关键词: 拟穴青蟹过敏原性质原肌球蛋白精氨酸激酶模拟胃肠液消化免疫印迹抑制性ELISA
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来食物过敏问题越来越受到人们的关注,每年由于过敏食物引起严重过敏反应的人不在少数,甚至危及生命。国内外的研究表明,由蟹类食物引起的过敏发病率逐渐上升,蟹类中含有两种重要过敏原:原肌球蛋白(tropomyosin, TM)和精氨酸激酶(arginine kinase, AK)。目前对于TM的研究较多,但大多集中在提取纯化及免疫学方面的研究;对于AK而言,则更多集中在酶学性质及分子克隆方面的研究。因此,加强对AK和TM的过敏原性质研究显得十分重要。本研究以拟穴青蟹为原料,首先对其AK和TM分别进行提取纯化,建立AK和TM的ELISA检测技术,并应用于水产品中AK和TM含量的检测。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western blotting)及酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法研究AK的理化性质及消化稳定性。其次,采用不同加工处理方法对蟹肉进行处理,分析加工处理对蟹肉TM的消化稳定性及致敏性的影响。最后采用体外模拟胃肠液二相消化实验比较AK和TM的消化稳定性,并对AK和TM的三级结构进行预测。采用硫酸铵盐析、柱层析等方法对AK进行提取纯化,首先对AK的温度、pH稳定性及消化稳定性作了相关研究,结果显示,AK为热不稳定蛋白,在温度达到46℃后,随着温度的升高,AK逐渐形成多聚体,进而凝聚形成沉淀,即发生了蛋白质变性作用。在强酸性缓冲液(pH 1.0 )中孵育1.5 h后可以发现AK产生了部分降解。参照美国药典中模拟胃、肠液消化实验方法,AK经胃蛋白酶消化1 h后原始条带被完全降解,但AK并不容易被肠液中的胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶降解,且肌浆蛋白中其他蛋白的存在会影响AK的模拟胃、肠液消化特性。其次,以纯化所得AK建立了ELISA检测技术,并对八种不同水产品中AK含量进行了检测。结果显示,甲壳类动物如南美白对虾、斑节对虾和虾蛄中AK的相对含量较高,而软体动物及双壳纲动物中AK含量则较低。采用等电点沉淀、硫酸铵盐析等方法对TM进行提取纯化,并通过不同加工方法(蒸煮、超声波结合蒸煮、高温高压、蟹肉罐头处理、烹饪处理等)处理蟹肉,参照美国药典中模拟胃、肠液消化实验方法,对处理后蟹肉的TM粗蛋白进行消化,分析其消化稳定性及消化产物的致敏性。结果显示,不同加工处理方法对蟹肉中TM的消化稳定性均有一定影响,其中高温高压处理能在较大程度上促进TM在模拟胃、肠液消化过程中的降解,TM及其消化产物的致敏性也有所降低。在蟹肉罐头加工处理过程中,植酸钠的添加能在一定程度上促进TM的降解,使其更容易被胃液及肠液分解。另外,在蟹类食品烹饪过程中添加适量的醋也能促进TM在模拟胃液中的消化分解。总结几种加工方法,高温高压处理在降低TM过敏性方面最为显著。同样以纯化所得TM建立了ELISA检测技术,对水产品中TM含量进行了检测。结果表明,甲壳类动物如南美白对虾、斑节对虾和虾蛄中TM的相对含量较高,而软体动物及双壳纲动物中TM含量则较低。最后,对蟹肉粗提液进行了体外模拟胃肠液二相消化实验,并对AK和TM的三级结构进行了预测分析。结果显示,在体外模拟胃肠液二相消化实验中,AK比TM容易被胃蛋白酶降解,而TM则对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的消化作用不耐受。此外,TM的三级结构比AK简单,主要为超螺旋结构,而AK则有复杂的空间结构,含有α-螺旋、β-折叠和β-转角,AK和TM三级结构的不同可能导致二者理化性质及消化稳定性方面的差异。总的来说,本研究分析了蟹类AK的理化性质及消化稳定性,首次证实AK为对热、酸均不稳定的过敏原。重点对蟹类TM的加工特性进行了探索,发现高温高压、植酸钠结合罐头处理、加醋烹饪的加工方法能够促进TM的消化降解及其致敏性的降低。采用体外模拟胃肠液二相消化实验对AK和TM的稳定性进行了比较,明确TM是更为稳定的过敏原。这些结果可望为蟹类过敏原性质及脱敏方面的深入研究提供依据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章引言  12-20
  1.1 食物过敏概述  12-13
  1.2 食物过敏原  13-16
    1.2.1 常见的食物过敏原  13-14
    1.2.2 水产食物过敏原  14-16
  1.3 食物过敏原的检测  16
  1.4 食品加工脱敏技术  16-18
  1.5 本文研究的目的和意义  18-20
第2章材料与方法  20-30
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 原料  20
    2.1.2 试剂  20-21
    2.1.3 实验所用溶液  21-22
    2.1.4 实验仪器  22
  2.2 实验方法  22-30
    2.2.1 蟹肉粗提液的制备  22-23
    2.2.2 肌浆蛋白、TM 粗蛋白的制备  23
    2.2.3 AK 和TM 的纯化  23-24
    2.2.4 纯化AK 的温度及pH 稳定性  24
    2.2.5 AK 的模拟胃、肠液消化实验  24-25
    2.2.6 蟹肉的不同加工方法处理  25
    2.2.7 TM 粗蛋白的模拟胃、肠液消化实验  25-26
    2.2.8 AK 和TM 的ELISA 检测技术  26
    2.2.9 蟹肉粗提液的模拟胃肠液二相消化实验  26
    2.2.10 AK 和TM 三级结构预测  26
    2.2.11 SDS-PAGE  26-27
    2.2.12 免疫印迹分析(Western blotting 和IgE-immunoblotting)  27-28
    2.2.13 抑制性ELISA (Inhibition ELISA)  28-30
第3章结果与分析  30-70
  3.1 AK 的过敏原性质  30-39
    3.1.1 AK 的纯化  30
    3.1.2 AK 的温度及pH 稳定性  30-31
    3.1.3 AK 的消化稳定性  31-36
    3.1.4 AK ELISA 检测技术的建立及应用  36-39
  3.2 TM 的过敏原性质  39-67
    3.2.1 TM 的纯化  39-40
    3.2.2 物理加工处理对TM 消化稳定性和致敏性的影响  40-48
    3.2.3 蟹肉罐头加工处理对TM 消化稳定性和致敏性的影响  48-56
    3.2.4 烹饪加工处理对TM 消化稳定性和致敏性的影响  56-63
    3.2.5 TM ELISA 检测技术的建立及应用  63-67
  3.3 AK 和TM 的消化稳定性比较  67-70
    3.3.1 蟹肉粗提液的模拟胃肠液二相消化实验  67-68
    3.3.2 AK 和TM 三级结构预测  68-70
第4章讨论与结论  70-77
  4.1 AK 的过敏原性质  71-72
  4.2 TM 的过敏原性质  72-74
  4.3 AK 和TM 的性质比较  74-75
  4.4 结论  75-76
  4.5 研究展望  76-77
致谢  77-78
参考文献  78-83
在学期间发表的学术论文  83

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