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鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特性研究

作　者: 韩龙
导　师: 杜翠红
学　校: 集美大学
专　业: 微生物学
关键词: 鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶毕赤酵母表达系统酶学特性新型蛋白工具酶
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）与胰蛋白酶的底物特异性类似，但其热稳定性优于哺乳动物的胰蛋白酶，可作为胰蛋白酶替代品。另外，在鱼糜加工过程中，MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因之一。因此，对鱼类MBSP的重组表达及其酶学特性研究，可为开发MBSP作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶及研制鱼类MBSP抑制剂提供理论依据。本文以淡水鲫鱼为研究对象，以鲫鱼肌肉中总RNA为模板，采用RT-PCR技术获得了鲫鱼MBSP基因（MBSP）片段，其开放阅读框为729bp，编码242个氨基酸残基，在其N-末端存在一个含20个氨基酸残基的信号肽。因此，成熟鲫鱼MBSP基因（MBSP2）大小为669bp，编码222个氨基酸残基。通过基因重组技术将成熟鲫鱼MBSP基因片段（MBSP2）整合到毕赤酵母的染色体上，成功构建了重组酵母表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP2。将该菌株在摇瓶中用1.0%甲醇进行诱导表达，在发酵液上清中可检测到分子量约36kDa的重组蛋白。Western blotting鉴定该重组蛋白为重组鲫鱼MBSP。同时，PAS染色证明了该重组鲫鱼MBSP为糖蛋白。在7L发酵罐中对重组酵母表达菌株GS115/pPIC9k-MBSP2进行高密度发酵，获得其适宜的工艺条件为：发酵温度在28.5-29.5℃之间、pH范围在5.2-5.8之间、溶氧量保持在30%以上、流加方式为溶氧控制、间断补加甲醇诱导32h。发酵结束时，发酵液OD600可达56.2，菌体湿重为123.9g/L。通过对不同分离纯化技术进行合理组合及其工艺条件的优化，建立了一套重组鲫鱼MBSP的分离纯化工艺流程：7L发酵罐中发酵→离心取发酵液上清→30-60%硫酸铵沉淀→透析→Q-Sepharose阴离子交换层析→超滤脱盐及浓缩→冷冻干燥。最终获得了重组鲫鱼MBSP的固体产品，可用于酶学性质分析及其应用研究。重组鲫鱼MBSP的酶学性质研究包括底物特异性、最适温度和温度稳定性、最适pH和酸碱稳定性、酶抑制剂和金属离子对其酶活的影响。底物特异性研究表明，重组鲫鱼MBSP可水解蛋白质中赖氨酸的羧基端肽键，而不识别精氨酸残基，这与蛋白质质谱鉴定中的工具酶Lys-C的水解特性相类似；其最适反应温度和pH分别为55℃和pH7.5；该酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性；丝氨酸蛋白酶抑制剂及高浓度金属离子可显著抑制其活性。此外，重组鲫鱼MBSP能快速降解鲫鱼肌原纤维蛋白，这与天然鲫鱼MBSP特性类似。将重组鲫鱼MBSP与蛋白质质谱鉴定中的工具酶Lys-C的酶学性质进行比较。结果表明，重组鲫鱼MBSP具有热稳定性高、pH适用范围宽、对底物的亲和力强及反应速度快等优势。另外，重组鲫鱼MBSP能有效降解如牛血清白蛋白（BSA）和精氨酸激酶等典型蛋白质。因此，重组鲫鱼MBSP有望作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章引言  12-16
  1.1 鲫鱼简介  12-13
  1.2 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究现状  13-14
  1.3 大肠杆菌表达系统和酵母表达系统  14-15
  1.4 蛋白质质谱鉴定中的工具酶  15
  1.5 研究目的和意义  15-16
第2章鲫鱼 MBSP 的基因克隆及毕赤酵母表达菌株的构建  16-42
  2.1 材料  16-20
    2.1.1 实验动物  16
    2.1.2 试剂及药品  16
    2.1.3 菌株及载体  16-17
    2.1.4 实验所需溶液及其配制  17-18
    2.1.5 主要培养基配制  18-19
    2.1.6 所用主要仪器  19-20
  2.2 方法  20-29
    2.2.1 引物设计  20-21
    2.2.2 总 RNA 的提取  21
    2.2.3 cDNA 的合成及 MBSP 基因序列的扩增  21-22
    2.2.4 鲫鱼 MBSP 基因（MBSP）的 T 克隆、测序及其序列分析  22-24
    2.2.5 重组酵母表达质粒 pPIC9K-MBSP2 的构建  24-25
    2.2.6 重组鲫鱼 MBSP 酵母表达菌株的构建  25-29
  2.3 结果与分析  29-41
    2.3.1 鲫鱼 MBSP 基因的扩增  29-31
    2.3.2 鲫鱼 MBSP 基因的 T 克隆及测序  31-32
    2.3.3 鲫鱼 MBSP 基因片段测序及其序列分析  32-34
    2.3.4 鲫鱼 MBSP 理化参数预测  34
    2.3.5 重组酵母表达质粒 pPIC9K-MBSP2 的构建  34-37
    2.3.6 重组鲫鱼 MBSP 毕赤酵母表达菌株的构建  37-41
  2.4 本章小结  41-42
第3章重组鲫鱼 MBSP 表达菌株的高密度发酵及重组鲫鱼 MBSP 的纯化  42-56
  3.1 材料  42-45
    3.1.1 菌种  42
    3.1.2 主要试剂及药品  42
    3.1.3 实验所需溶液及其配制  42-43
    3.1.4 主要培养基配制  43-44
    3.1.5 所用主要仪器  44-45
  3.2 方法  45-49
    3.2.1 种子培养  45
    3.2.2 发酵过程  45
    3.2.3 发酵过程中的参数测定  45-46
    3.2.4 硫酸铵沉淀  46-47
    3.2.5 离子交换层析  47
    3.2.6 超滤脱盐、浓缩及冷冻干燥  47
    3.2.7 酶活测定  47-49
  3.3 结果与讨论  49-54
    3.3.1 发酵过程中取样实测数据  49
    3.3.2 发酵过程中的生长曲线和湿重曲线  49-50
    3.3.3 发酵过程培养基上清的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  50-51
    3.3.4 硫酸铵分级沉淀中硫酸铵饱和度范围的确定  51-52
    3.3.5 离子交换层析结果  52-54
    3.3.6 重组鲫鱼 MBSP 的纯化表格  54
    3.3.7 重组鲫鱼 MBSP 的生产工艺流程  54
  3.4 本章小结  54-56
第4章重组鲫鱼 MBSP 的酶学特性及其作为蛋白工具酶的应用研究  56-72
  4.1 材料  56-57
    4.1.1 实验动物  56
    4.1.2 主要试剂及药品  56
    4.1.3 实验所需溶液及其配制  56-57
    4.1.4 所用仪器  57
  4.2 方法  57-60
    4.2.1 重组鲫鱼 MBSP 的酶学特性研究  57-60
    4.2.2 重组鲫鱼 MBSP 作为蛋白工具酶的应用研究  60
  4.3 结果与讨论  60-70
    4.3.1 重组鲫鱼 MBSP 的底物特异性分析  60-61
    4.3.2 重组鲫鱼 MBSP 的性质分析  61-63
    4.3.3 不同蛋白酶抑制剂、表面活性剂、还原剂、变性剂和金属离子对重组鲫鱼 MBSP 的影响  63-65
    4.3.4 重组鲫鱼 MBSP 对鲫鱼肌原纤维蛋白的降解情况  65-66
    4.3.5 重组鲫鱼 MBSP 与蛋白内切酶 Lys-C 的酶动力学参数及酶学性质比较  66-69
    4.3.6 重组鲫鱼 MBSP 对几种典型蛋白质的降解情况  69-70
  4.4 本章小结  70-72
第5章结论和展望  72-74
  5.1 结论  72-73
  5.2 展望  73-74
致谢  74-75
参考文献  75-78
附录  78-80
在学期间发表的学术文章  80

鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特性研究

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