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中华鳖肝脏蛋白磷酸酶的提取纯化及其酶学特性研究

作　者: 陆红法
导　师: 陈小龙；吴美仙
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物工程
关键词: 中华鳖蛋白磷酸酶提纯 pNPP 酶学特性
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本文对中华鳖肝脏中的蛋白磷酸酶的分离纯化方法及其酶学特性进行了研究。纯化过程为:组织匀浆、冷冻离心机高速离心、硫酸铵盐析沉淀,测得较合适盐析方案为:（1）在pH值8.5情况下,先用30%饱和度硫酸铵除去碱性杂蛋白;（2）在pH6.7-6.9情况下,再用30-70%饱和度的硫酸铵沉淀出PP2A,透析、上DEAE—纤维素DE-52柱进行离子交换层析,用pH8.1的Tris缓冲液（含0.2mol/mLNaCl）洗脱,柱1.5×5.0cm,流速0.60mL/min,收集速度3mL/管,收集得到4个蛋白峰,其中峰Ⅰ是PI值比PP2A高的杂蛋白,峰Ⅱ和峰Ⅲ具有很高的酶活性,峰Ⅳ是PI值比PP2A低的杂蛋白。再用超滤脱去峰Ⅱ和峰Ⅲ小分子蛋白,得到PP2A,比活力达到159.0,提纯倍数为18.75。酶学分析结果表明:PP2A在pH值为6.0-8.0,温度为0℃以下时十分稳定,不容易失活,其PI值小于7,是一个弱酸性蛋白质。但在酸性条件下（pH＜4）和碱性条件下（pH＞10）放置2,4,6hr时,或温度超过45℃,10min以后,几乎检测不到酶活。以pNPP为底物,测得PP2A的最佳反应条件为pH7.0左右,温度30℃,底物浓度为28-29μmol/mL。pNPP对PP2A有明显的抑制作用,当浓度超过29μmol/mL时,酶的活性开始快速下降,而当浓度大于48μmol/mL时,下降速度明显减缓。作为PP2A的一个底物,pNPP不满足米氏方程所需的条件,因此不能用米氏方程考察其酶促反应动力学。重金属离子如Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等则可大大地激活酶的活性,它们分别使PP2A的活性提高2132%、1463%、1390%、411%。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
引言  8-11
第一章文献综述  11-28
  1 蛋白磷酸酶简介  11-12
  1.2 PP的分类  12-15
  1.3 PP结构及催化反应机理  15-19
  1.4 PP抑制剂  19-23
    1.4.1 S/T抑制剂  19-22
    1.4.2 PTP抑制剂  22-23
  1.5 蛋白磷酸酶的分离纯化方法  23-28
第二章研究方法  28-36
  2.1 材料  28
  2.2 试剂与仪器  28-29
    2.2.1 试剂  28-29
    2.2.2 仪器  29
  2.3 实验方法  29-36
    2.3.1 试剂的配制  29-30
    2.3.2 分析方法  30-36
      2.3.2.1 酶活的测定方法  30-31
      2.3.2.2 蛋白磷酸酶的提取和纯化  31-32
      2.3.2.3 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度  32-33
        2.3.2.3.1 蛋白质标准曲线的建立  32
        2.3.2.3.2 样品浓度的测定  32-33
      2.3.2.4 PP2A的稳定性研究  33
        2.3.2.4.1 对pH的稳定性  33
        2.3.2.4.2 对温度的稳定性  33
      2.3.2.5 PP2A的最适反应条件研究  33-36
        2.3.2.5.1 pH值  33
        2.3.2.5.2 温度  33-34
        2.3.2.5.3 底物浓度  34
        2.3.2.5.4 二价金属离子对酶促反应的影响  34
        2.3.2.5.5 酶的基本动力学常数的考察  34-36
第三章结果与讨论  36-48
  3.1 蛋白磷酸酶(PP2A)的纯化  36-40
    3.1.1 硫酸铵较佳盐析方案的确定  36-39
    3.1.2 DEAE-纤维素离子交换层析  39-40
    3.1.3 蛋白磷酸酶纯化总结表  40
  3.2 蛋白质浓度标准曲线及蛋白质浓度  40-41
  3.3 底物浓度标准曲线  41-42
  3.4 稳定性  42-43
  3.5 最适反应条件  43-46
    3.5.1 pH值  43-44
    3.5.2 温度  44-45
    3.5.3 底物浓度  45-46
    3.5.4 二价金属离子对酶促反应的影响  46
  3.6 酶的基本动力学常数的考察  46-48
第四章总结  48-50
  4.1 蛋白磷酸酶的分离纯化  48
  4.2 蛋白磷酸酶的酶学特性研究  48-50
致谢  50-51
参考文献  51-59
攻读学位期间发表的学术论文  59

中华鳖肝脏蛋白磷酸酶的提取纯化及其酶学特性研究

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