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海洋溶藻弧菌BS02及其活性物质作用机理的研究

作　者: 李东
导　师: 林毅
学　校: 华侨大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 弧菌微泡菌塔玛亚历山大藻棕榈油酸
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

有害赤潮的频繁爆发，不仅威胁了海洋经济的可持续发展，也威害到了人类的身心健康。溶藻细菌的发现为“以菌治藻”提供了可能，其安全、高效的潜能为微生物防治赤潮提供了新的思路和方法，势必成为赤潮生物防治的重要手段。本研究从福建省漳江口红树林区沉积物中分离、筛选了2株海洋高效溶藻细菌，追踪研究了这2株溶藻细菌对有害赤潮藻——塔玛亚历山大藻的溶藻性质；随后从藻细胞结构、抗氧化系统、光合系统及基因表达水平上探讨了BS02菌株的溶藻机制；最后采用柱层析分离纯化、质谱和核磁共振技术鉴定了细菌发酵液中起主要溶藻作用的活性代谢产物。以期为更好的利用溶藻细菌来防治频繁爆发赤潮灾害提供充足的理论基础。研究所得主要结论如下：（1）分离、筛选获得2株高效溶藻细菌。分类学研究表明，溶藻菌株BS02与弧菌属（Vibrio sp.）的vibrio. VulnificusATCC27562菌株序列相似性为97.0%，而溶藻菌株BS03与微泡菌属（Microbulbifer sp.）的Microbulbifer donghaiensisCN85菌株序列相似性达99%，结合菌株形态、菌落特征及生理生化指标，确定菌株BS02为弧菌属（Vibrio）菌株BS03为微泡菌属（Microbulbifer）。（2）溶藻菌株BS02、BS03对塔玛亚历山大藻的溶藻作用具有一定的浓度依赖性，溶藻效果在一定范围内随着处理浓度的增大而增强。2.0%（v/v）浓度处理4d后杀藻率均可达到85%以上，而0.25%和0.5%浓度处理后反而促进藻类生长。溶藻方式研究表明，2株菌株的菌体悬浮液均无溶藻活性，而无菌发酵上清液和原发酵液的溶藻效果相当，杀藻率均可达到90%左右，这说明菌株BS02和BS03均是通过分泌胞外代谢活性物质而实现间接溶藻，菌体本身不具有溶藻活性。（3）杀藻谱测试结果显示，溶藻菌株BS02对小球藻（Chlorella），热带骨条藻（Skeletonema tropicum），三角褐指藻（Phaeodactylum），自养小球藻（Chlorellaautotrophica），日本星杆藻（Asterionella japonica），叉鞭金藻（Dicrateriainornata），亚心型扁藻（Platymonas subcordlformls），微小亚历山大藻（Alexandrium minutum)和锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）均表现出溶藻效果（杀藻率50~70%）；而对其它所测试的9株藻种均未表现出溶藻效果。而菌株BS03对所测试的扁面角毛藻（Chaetoceros compressus）、海洋卡盾藻（Chattonella marina）和东海原甲藻（Prorocentrum.donghaiense）表现出强的杀藻效果（溶藻率>70%），对威氏海链藻Thalassiosira weissflogii）、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）、青岛大扁藻（Platymonas helgolandica）、翼茧形藻（Amphiprora alata）及链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）表现出溶藻效果（杀藻率50~70%），而对其它测试的10株藻种均未表现出杀藻效果。这些结果说明，菌株BS02和BS03的溶藻作用具有一定的种属特异性。（4）溶藻菌株BS02处理目标藻后，首先导致了藻细胞结构明显变化，如质壁分离，细胞壁和细胞膜部分溶解，叶绿体、线粒体、细胞核等主要细胞器结构的变形。伴随这些细胞结构变化的同时，藻细胞内部的各种生理生化指标也在变动，活性氧ROS的胁迫增多，启动了藻细胞的抗氧化系统，导致超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）两种酶活性先升高后下降，而丙二醛（MDA）酶活性则持续升高。藻细胞光合色素含量的降低，光合荧光效率Fv/Fm值的下降，直接表明藻细胞光合作用的受到明显影响。Caspase-3酶活性的变化，揭示了藻细胞在溶藻过程中可能经历了细胞程序性死亡的过程。（5）在溶藻菌株BS02胁迫下，藻PS II中心反应蛋白D1和D2的编码基因psbA和psbD的相对表达量均出现变化，其中psbA基因的表达量下调，而在所测试的时间内psbD基因的转录表达却异常活跃；细胞色素代谢相关基因cob和cox的表达量均明显下调。这些结果表明，溶藻菌的活性成分可使藻PS II光反应中心受损，并伴随着电子传递链的阻断，干扰光合作用，进而对细胞的生长生存构成威胁。（6）溶藻菌株BS02所分泌的胞外溶藻物质为一类分子量小于1kDa，耐酸碱、具热稳定性的非蛋白、非核酸、非多糖类物质。经色谱柱层析，核磁共振等分离鉴定方法，确定该活性物质为棕榈油酸（palmitoleic acid）（分子量为254，分子式为C16H30O2）。溶藻活性试验表明棕榈油酸对A.tamarense具有稳定的溶解效果，其中20μg/mL浓度的棕榈油酸就可以抑制藻细胞的生长，随着浓度的加大这种抑制效果越加明显甚至杀死藻细胞。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-8
目录  8-13
主要符号对照表  13-14
第1章引言  14-34
  1.1 赤潮概述  14
  1.2 赤潮成因  14-15
    1.2.1 水体环境的富营养化  14-15
    1.2.2 自然因素  15
  1.3 赤潮的危害  15-16
  1.4 我国赤潮现状  16-18
  1.5 赤潮的防治  18-19
    1.5.1 赤潮的预防  18
    1.5.2 赤潮的治理  18-19
  1.6 赤潮的生物法防治  19-22
    1.6.1 植物化感作用  20
    1.6.2 微生物防治赤潮  20-22
  1.7 溶藻细菌的研究进展  22-25
    1.7.1 溶藻细菌在赤潮治理中的角色  22
    1.7.2 溶藻细菌的溶藻作用方式  22-25
  1.8 溶藻活性物质的研究进展  25-27
    1.8.1 蛋白质  25
    1.8.2 多肽  25
    1.8.3 氨基酸  25-26
    1.8.4 表面活性剂  26
    1.8.5 抗生素  26
    1.8.6 其它  26-27
  1.9 溶藻细菌溶藻机理的研究进展  27-30
    1.9.1 细胞水平  27-28
    1.9.2 功能酶及蛋白水平  28-29
    1.9.3 基因水平  29-30
    1.9.4 其它方面影响  30
  1.10 溶藻机理的研究方法  30
  1.11 本研究内容及意义  30-34
第2章溶藻菌株的筛选  34-48
  2.1 材料  34-37
    2.1.1 样品  34
    2.1.2 藻种  34-35
    2.1.3 菌株、质粒、载体和引物  35
    2.1.4 主要试剂盒和工具酶  35
    2.1.5 主要药品和试剂  35-36
    2.1.6 主要培养基  36-37
    2.1.7 主要仪器  37
    2.1.8 主要分析软件及辅助工具  37
  2.2 实验方法  37-40
    2.2.1 藻的培养  37-38
    2.2.2 杀藻效果评价  38
    2.2.3 溶藻菌株的分离鉴定  38-40
  2.3 结果与分析  40-45
    2.3.1 溶藻菌株的分离、筛选  40-42
    2.3.2 溶藻菌株分子生物学鉴定  42-44
    2.3.3 溶藻细菌 BS02、BS03 溶藻效果的测定  44-45
  2.4 小结与讨论  45-48
第3章溶藻菌株溶藻特性的初探  48-62
  3.1 材料  48-49
    3.1.1 菌种  48
    3.1.2 藻种  48
    3.1.3 培养基与培养条件  48-49
    3.1.4 主要仪器设备  49
  3.2 实验方法  49-51
    3.2.1 不同浓度，不同时间的溶藻菌株对塔玛亚历山大藻生长的影响  49
    3.2.2 溶藻菌株溶藻作用方式的探讨  49-50
    3.2.3 塔玛亚历山大藻与溶藻菌株所处生长期对溶藻效果的影响  50
    3.2.4 溶藻细菌溶藻种属特异性研究  50
    3.2.5 溶藻菌株溶藻过程的观察  50-51
  3.3 结果与分析  51-59
    3.3.1 溶藻菌株 BS02、BS03 发酵液对塔玛亚历山大藻生长的影响  51-52
    3.3.2 溶藻菌株溶藻作用方式的探讨  52-54
    3.3.3 溶藻菌株溶藻种属特异性研究  54-55
    3.3.4 塔玛亚历山大藻与溶藻菌株所处生长期对溶藻效果的影响  55-58
    3.3.5 溶藻菌株溶藻过程的观察  58-59
  3.4 小结与讨论  59-62
第4章溶藻菌株溶藻作用机理的研究  62-96
  4.1 材料  62-64
    4.1.1 菌种与藻种  62
    4.1.2 主要实验试剂与仪器  62-64
  4.2 方法  64-76
    4.2.1 溶藻菌株 BS02 对塔玛亚历山大藻藻细胞结构的影响  65-67
    4.2.2 溶藻菌株 BS02 胁迫下藻细胞抗氧化系统的响应  67-70
    4.2.3 藻细胞 Caspase-3 蛋白酶活性检测  70
    4.2.4 溶藻菌株 BS02 对塔玛亚历山大藻藻细胞光合作用的影响  70-71
    4.2.5 溶藻菌株 BS02 胁迫下塔玛亚历山大藻藻细胞基因水平的响应  71-76
  4.3 结果与分析  76-92
    4.3.1 溶藻菌株 BS02 对塔玛亚历山大藻藻细胞结构的影响  76-79
    4.3.2 菌株 BS02 胁迫下塔玛亚历山大藻抗氧化系统的响应  79-82
    4.3.3 藻细胞 Caspase-3 蛋白酶活性检测  82-83
    4.3.4 光合色素及其最大光合效率测定  83-86
    4.3.5 溶藻菌株 BS02 作用下塔玛亚历山大藻基因表达响应  86-92
  4.4 小结与讨论  92-96
第5章溶藻菌株溶藻活性物质的分离纯化  96-116
  5.1 材料  96-97
    5.1.1 菌种与藻种  96
    5.1.2 培养基与培养条件  96
    5.1.3 主要仪器设备及耗材  96-97
    5.1.4 主要试剂  97
  5.2 实验方法  97-102
    5.2.1 实验  97-98
    5.2.2 溶藻菌株 BS02 活性物质理化性质检验  98
    5.2.3 乙醇沉淀  98
    5.2.4 不同温度、pH 处理  98
    5.2.5 有机溶剂萃取  98-99
    5.2.6 溶藻菌株 BS02 活性物质的分离纯化  99
    5.2.7 溶藻活性验证实验  99-100
    5.2.8 溶藻活性物质的鉴定  100-102
    5.2.9 溶藻活性物质对塔玛亚历山大藻的抑制作用  102
  5.3 结果与讨论  102-112
    5.3.1 透析实验  102
    5.3.2 溶藻菌株 BS02 活性物质理化性质检验  102-104
    5.3.3 乙醇沉淀  104
    5.3.4 不同温度和 pH 处理  104-106
    5.3.5 不同有机溶剂萃取  106
    5.3.6 溶藻菌株 BS02 溶藻活性物质的分离纯化  106-110
    5.3.7 溶藻活性物质对塔玛亚历山大藻的抑制作用  110-112
  5.4 小结与讨论  112-116
第6章结论与展望  116-120
  6.1 结论  116-117
  6.2 论文创新点  117-118
  6.3 展望  118-120
参考文献  120-132
致谢  132-134
附录  134-142
  附录 A 核磁共振相关图谱  134-136
  附录 B 相关基因序列  136-139
  附录 C 载体图谱  139-140
  附录 D DNA/RNA 分子量标准  140-142
个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果  142-143
  个人简历  142
  发表和待发表的学术论文  142-143
  专利申报  143

海洋溶藻弧菌BS02及其活性物质作用机理的研究

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