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牙鲆肠弧菌密度感应系统的研究及其信号分子降解菌株的筛选

作　者: 李轩
导　师: 张晓华；韩茵
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 牙鲆肠弧菌 N-酰基高丝氨酸内酯 AI-2 CAI-1 luxS突变 AHL降解
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

密度感应(Quorum Sensing)是细菌监控自身群体密度的环境信号感受系统。细菌在繁殖过程中分泌一些特定的化学信号分子,这种信号分子从胞内扩散到胞外,当这种信号分子达到一定的阈值时,细菌感受到自身的细胞密度,启动某些基因的表达,这一过程称为密度感应。目前,已在许多革兰氏阳性菌和阴性菌中发现了密度感应系统,并调控许多基因的表达。已有研究证实了一些病原性弧菌通过自身复杂的密度感应系统来调控致病因子的表达。本研究使用了报告菌株根癌农杆菌KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410),检测发现牙鲆肠弧菌DA3有三种不同的酰基高丝氨酸内酯类自诱导分子(acyl-homoserine lactone, AHLs)。由于这三种AHL信号分子不可以被报告菌株紫色杆菌CV026检测出来,我们推测它们可能有着较长的N-酰基侧链或者特殊的侧链基团,例如羟基侧链基团。它们的结构性质目前仍旧未知,需要通过HPLC-MS分析进行更进一步的研究。DA3在整个生长阶段都产生AHL信号分子,其活性随着细菌的密度增加而增强。DA3也可产生AI-2类自诱导分子(autoinducer-2,AI-2);AI-2信号分子在对数生长期开始积累并迅速达到一定的活性水平,并且保持在这一较高的活性水平直到细菌生长的稳定期。本研究进一步克隆了DA3 luxS基因的全长序列并发现其与大菱鲆弧菌的luxS基因有99.6%的相似性。luxS基因突变株M-2丧失产生AI-2信号分子的能力,生长率和生物膜的产生均未受到影响,且未显著影响牙鲆肠弧菌的致病性。所有数据表明,luxS基因与牙鲆肠弧菌的致病性没有直接的调控关系,或者牙鲆肠弧菌的致病性是由其它不同的密度感应系统协同调控,仅失去luxS基因的调控并不能降低其致病性。牙鲆肠弧菌DA3与其标准菌株LMG19664T都不产生霍乱弧菌Ⅰ类自体诱导分子(cholerae autoinducer-1,CAI-1)。已报道AHL介导的密度感应系统存在参与弧菌病原菌毒力的调控,如哈维氏弧菌,鳗弧菌等,因此干扰AHL介导的密度感应系统是一种新的抗感染策略。研究表明芽孢杆菌产生的AiiA酶,可水解AHLs的乙酰链、高丝氨酸内脂的氨基键或内酯环的酯键,而使AHLs失活。本研究从自然海区分离了37株芽孢杆菌菌株,筛得5株对Da3具有较强AHL降解活性的菌株,为下一步在鱼体内拮抗牙鲆肠弧菌提供了理论依据。这是关于牙鲆肠弧菌密度感应系统的首次研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章引言  10-24
  1.1 我国的水产养殖病害概述  10-11
  1.2 牙鲆肠弧菌的研究概况  11-12
  1.3 密度感应系统的研究概况  12-22
    1.3.1 密度感应系统的研究历史  12-13
    1.3.2 细菌的密度感应系统  13-18
      1.3.2.1 革兰氏阴性菌的LuxR/I型密度感应系统  13-14
      1.3.2.2 革兰氏阳性菌的寡肽介导的密度感应系统  14-15
      1.3.2.3 LuxS/AI-2型的密度感应系统  15-16
      1.3.2.4 CAI-1型的密度感应系统  16-18
    1.3.3 细菌密度感应系统的应用  18-21
      1.3.3.1 抑制信号分子的生物合成  18-19
      1.3.3.2 密度感应信号分子的酶失活和生物降解  19-20
      1.3.3.3 密度感应系统拮抗剂的应用  20
      1.3.3.4 密度感应系统信号分子的化学失活  20-21
    1.3.4 密度感应系统的检测  21-22
  1.4 本论文研究的目的和意义  22-24
第二章牙鲆肠弧菌密度感应系统的研究  24-36
  2.1 实验材料与方法  24-30
    2.1.1 菌种  24-26
    2.1.2 培养基  26
    2.1.3 实验试剂和仪器  26-27
    2.1.4 海洋弧菌上清液的制备  27
    2.1.5 牙鲆肠弧菌AHL分子的检测  27-29
      2.1.5.1 双层平板法检测牙鲆肠弧菌AHL分子  27-28
      2.1.5.2 平板划线法检测牙鲆肠弧菌AHL分子  28
      2.1.5.3 牙鲆肠弧菌AHL分子活性检测  28
      2.1.5.4 牙鲆肠弧菌AHL分子的TLC板检测  28-29
    2.1.6 牙鲆肠弧菌AI-2分子的检测  29
    2.1.7 牙鲆肠弧菌CAI-1分子的检测  29-30
  2.2 实验结果与分析  30-34
    2.2.1 牙鲆肠弧菌AHL分子的检测  30-32
    2.2.2 牙鲆肠弧菌AI-2分子的检测  32-33
    2.2.3 牙鲆肠弧菌CAI-1分子的检测  33-34
  2.3 讨论  34-36
第三章牙鲆肠弧菌AI-2密度感应系统LUXS基因的克隆与突变  36-50
  3.1 实验材料与方法  36-45
    3.1.1 菌种  36-37
    3.1.2 培养基  37-38
    3.1.3 实验试剂和仪器  38
    3.1.4 牙鲆肠弧菌luxS基因全长的克隆  38-41
      3.1.4.1 牙鲆肠弧菌DNA样品的制备  38-39
      3.1.4.2 牙鲆肠弧菌luxS引物的合成  39
      3.1.4.3 牙鲆肠弧菌luxS的PCR扩增  39
      3.1.4.4 牙鲆肠弧菌luxS扩增产物的检测及纯化  39-40
      3.1.4.5 感受态细胞的制备  40
      3.1.4.6 pUC/luxS克隆质粒的转化  40-41
      3.1.4.7 牙鲆肠弧菌luxS基因序列分析  41
    3.1.5 牙鲆肠弧菌luxS基因的突变  41-45
      3.1.5.1 牙鲆肠弧菌luxS基因突变引物设计  41
      3.1.5.2 PCR扩增牙鲆肠弧菌luxS的突变片段  41-42
      3.1.5.3 luxS突变片段PCR扩增产物的T载体克隆  42
      3.1.5.4 重组自杀质粒的构建  42-44
      3.1.5.5 牙鲆肠弧菌luxS突变株的构建  44-45
    3.1.6 牙鲆肠弧菌luxS基因突变株AI-2分子活性的检测  45
    3.1.7 牙鲆肠弧菌luxS基因突变株致病性的检测  45
    3.1.8 牙鲆肠弧菌luxS基因突变株生物膜的检测  45
  3.2 实验结果与分析  45-49
    3.2.1 牙鲆肠弧菌luxS基因全长的克隆及序列分析  45-47
    3.2.2 牙鲆肠弧菌luxS基因突变株的构建  47-48
    3.2.3 牙鲆肠弧菌luxS基因突变株AI-2分子活性的检测  48-49
    3.2.4 牙鲆肠弧菌luxS基因突变株致病性与生物膜的检测  49
  3.3 讨论  49-50
第四章牙鲆肠弧菌信号分子降解菌株的筛选  50-56
  4.1 实验材料与方法  50-52
    4.1.1 菌种  50
    4.1.2 培养基  50-51
    4.1.3 实验试剂和仪器  51
    4.1.4 芽孢杆菌菌株对牙鲆肠弧菌DA3 AHL分子活性降解的定性检测  51-52
    4.1.5 芽孢杆菌菌株对牙鲆肠弧菌DA3 AHL分子活性降解的定量检测  52
  4.2 实验结果与分析  52-54
  4.3 讨论  54-56
论文总结  56-58
参考文献  58-67
致谢  67-68
个人简历  68
发表和撰写的文章  68

牙鲆肠弧菌密度感应系统的研究及其信号分子降解菌株的筛选

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