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鸭疫里默氏杆菌氨基糖苷类和喹诺酮类耐药基因的检测与序列分析

作　者: 杨芳芳
导　师: 姜世金
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭疫里默氏杆菌氨基糖苷类药物耐药性喹诺酮类药物耐药性 MIC 耐药基因序列分析
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestfer, RA）引起的一种急性或慢性败血性传染病，主要感染2～8周龄的雏鸭，鹅，火鸡及其它家禽和野禽，该病的发病率和死亡率都很高，对养鸭业造成了严重的经济损失。目前在防治该病时，由于对抗生素的不合理使用，导致了RA对氨基糖苷类和喹诺酮类等多种抗生素产生了耐药性，甚至出现了多重耐药菌株。本试验通过对实验室保存的38株RA进行氨基糖苷类和喹诺酮类药物耐药性的研究以及耐药基因的检测，以便更好的指导临床用药。1、RA对氨基糖苷类和喹诺酮类药物耐药表型的研究本研究采用WHO推荐的K-B纸片法对本实验室保存的38株RA进行5种氨基糖苷类药物和4种喹诺酮类药物的敏感性试验，并采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法进行庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星和诺氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）的测定。药敏试验结果显示，38株RA对氨基糖苷类药物即庆大霉素、链霉素、阿米卡星、新霉素和卡那霉素的耐药率分别为76.3%、71.1%、55.3%、50.0%和39.5%；对喹诺酮类药物即诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星和氧氟沙星的耐药率分别为55.3%、52.6%、44.7%和28.9%。其中有33株RA对两种或多种药物产生耐药性，占RA总数的86.8%，且有2株菌对9种药物全部耐药,占RA总数的5.3%。最低抑菌浓度（MIC）的测定结果显示，38株RA对庆大霉素、阿米卡星、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为63.2%，50%，60.5%和55.3%。以上结果表明，本实验室保存的38株RA对多种氨基糖苷类和喹诺酮类药物耐药，且多重耐药的现象比较严重。2、38株RA中氨基糖苷类耐药基因的检测及序列分析本试验利用PCR方法对38株RA中介导氨基糖苷类药物耐药的氨基糖苷类钝化酶基因（ant(3’’)-Ia、aac(6’)-Ib和aph(3’)-IIa）和16S甲基化酶基因（armA、rmtA和mtB）分别进行了检测和序列的测定与分析。结果显示，38株RA中介导氨基糖苷类药物耐药的氨基糖苷类钝化酶基因ant(3’’)-Ia、aac(6’)-Ib和aph(3’)-IIa的检出率分别为31.6%（12/38）、89.5%（34/38）和94.7%（36/38），与大肠杆菌中同种耐药基因的同源性分别为96.1%～100%、98.4～100%和98.9%～100%，与沙门氏菌中ant(3’’)-Ia、aac(6’)-Ib两种耐药基因的同源性分别为94.3%～100%和98.4～100%。未检测到介导氨基糖苷类药物高水平耐药的16S甲基化酶基因。3、38株RA中质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测及序列分析本试验利用PCR方法对38株RA中质粒介导喹诺酮类药物耐药的qnr基因（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS），QepA基因和oqxAB基因分别进行了检测和序列测定与分析。结果表明，38株RA中由质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因仅检测到qnrS基因，检出率为28.9%（11/38），与大肠杆菌的同种耐药基因的同源性为91.8%～99.8%，与沙门氏菌的同种耐药基因的同源性为91.6%～98.8%。在对介导氨基糖苷类药物耐药的氨基糖苷类钝化酶基因aac(6’)-Ib基因的阳性序列进行序列分析时，发现34株阳性菌中有4株菌携带的是aac(6’)-Ⅰb-cr，即在102位(W→R)和179位（D→Y）氨基酸同时发生突变，占阳性菌的11.8%，可以介导对喹诺酮类药物低水平的耐药。

全文目录

符号及缩略词  4-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-27
  1.1 鸭疫里默氏杆菌的研究进展  12-15
    1.1.1 RA 的形态结构、培养特性及理化特性  12-13
    1.1.2 血清型  13-14
    1.1.3 流行病学、临床症状及病理变化  14
    1.1.4 诊断与预防治疗  14-15
  1.2 细菌对氨基糖苷类药物的耐药性研究  15-19
    1.2.1 细菌的耐药性  15
    1.2.2 氨基糖苷类抗菌药物的分类及作用机制  15-16
    1.2.3 氨基糖苷类药物的耐药机制  16-19
  1.3 质粒介导的喹诺酮类耐药  19-26
    1.3.1 喹诺酮类药物的发展  19-20
    1.3.2 喹诺酮类药物的作用机制  20
    1.3.3 喹诺酮类药物的耐药机制  20-21
    1.3.4 质粒编码的喹诺酮类药物耐药基因  21-26
  1.4 RA 中的耐药基因研究现状  26
  1.5 本研究的目的和意义  26-27
2 材料及方法  27-36
  2.1 鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药表型  27-29
    2.1.1 试验菌株  27
    2.1.2 供试药物及培养基  27
    2.1.3 RA 对数生长期的测定  27
    2.1.4 普通药敏纸片试验  27-28
    2.1.5 体外最低抑菌浓度（MIC）测定  28-29
  2.2 鸭疫里默氏杆菌中氨基糖苷类和喹诺酮类耐药基因的检测及克隆测序  29-36
    2.2.1 试验菌株  29
    2.2.2 分子生物学试剂及培养基  29
    2.2.3 电泳缓冲液  29
    2.2.4 琼脂糖凝胶的配制  29
    2.2.5 实验仪器设备  29-30
    2.2.6 引物的设计及合成  30-31
    2.2.7 PCR 反应  31
    2.2.8 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳  31-32
    2.2.9 PCR 产物的回收与定量  32-33
    2.2.10 回收目的片段的连接及转化  33-34
    2.2.11 重组质粒 DNA 的提取  34-35
    2.2.12 重组质粒的酶切鉴定  35
    2.2.13 阳性克隆序列测定  35-36
3 结果与分析  36-50
  3.1 鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药表型  36-41
    3.1.1 RA 对数生长期的测定  36
    3.1.2 普通药敏纸片试验结果  36-38
    3.1.3 多重耐药结果  38
    3.1.4 体外最低抑菌浓度的测定结果  38-41
  3.2 38 株 RA 中氨基糖苷类耐药基因的检测及分析结果  41-46
    3.2.1 菌株 PCR 扩增 RA 中氨基糖苷类耐药基因的结果  41-42
    3.2.2 氨基糖苷类耐药基因重组质粒的双酶切鉴定结果  42-43
    3.2.3 RA 中氨基糖苷类耐药基因的携带情况及同源性比对  43-46
    3.2.4 RA 中检测到的氨基糖苷类钝化酶基因的序列号  46
  3.3 质粒介导的喹诺酮类耐药基因的检测及分析结果  46-50
    3.3.1 菌株 PCR 扩增 RA 中喹诺酮类耐药基因的结果  46-47
    3.3.2 喹诺酮类耐药基因重组质粒的双酶切鉴定结果  47
    3.3.3 RA 中氨基糖苷类耐药基因的携带情况及同源性比对  47-48
    3.3.4 介导喹诺酮类药物耐药的新基因的发现  48-50
4 讨论  50-53
  4.1 鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药性研究  50-51
  4.2 鸭疫里默氏杆菌中氨基糖苷类耐药基因的检测及分析  51
  4.3 鸭疫里默氏杆菌中喹诺酮类耐药基因的检测及分析  51-53
5 结论  53-54
6 参考文献  54-66
致谢  66-67
攻读硕士期间发表论文情况  67

鸭疫里默氏杆菌氨基糖苷类和喹诺酮类耐药基因的检测与序列分析

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