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鸭疫里默氏杆菌特异性单克隆抗体的研制以及生物被膜和OmpA缺失株的研究

作　者: 周小进
导　师: 丁铲；秦爱建；于圣青
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体生物被膜 OmpA 缺失
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鸭疫里默氏杆菌病(俗称鸭传染性浆膜炎)是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鸭、鹅、火鸡等多种其他鸟类的一种高致病性、接触传染性疾病。目前已报道的RA血清型有21个,各血清型之间缺乏交叉保护,给该病的疫苗防治带来了不便。国内养鸭集中地区的绝大多数鸭场都发生过RA感染,且存在持续性感染的问题,其机制到目前为止还未知。另外,目前对RA致病机制以及毒力因子的研究仍属空白。本研究通过制备血清1型、2型RA的单抗来检测其与RA不同血清型分离株的交叉反应性,旨在寻找各血清型RA之间的共同抗原用于免疫诊断和疫苗研制。本研究共获得了14株针对血清1型RA的单抗和12株针对血清2型RA的单抗。ELISA试验表明14株血清1型单抗对相同血清1型菌株和血清6型、12型以及15型菌株均有反应性,说明血清1、6、12和15型RA之间存在共同的抗原表位。12株血清2型单抗中的3株与所有被检测的RA菌株都有反应性,说明不同血清型RA菌株具有共同的抗原表位。生物被膜的形成通常与细菌的毒力相关。本试验测定了43株RA的生物被膜形成能力,并测定了CH3菌株形成生物被膜后生化特性的变化以及具有不同生物被膜形成能力的3株RA分离株的雏鸭致病性。结果表明RA菌株能形成生物被膜(18/43),葡萄糖能抑制生物被膜的形成但蔗糖对生物被膜的形成基本没有影响,生物被膜的形成增强了RA对抗生素和去污剂的抵抗。RA生物被膜的形成能力与致病性无直接相关性,但形成生物被膜后对环境抵抗力的增强能使该菌长期存活,因此也许是鸭场中RA感染持续性存在的原因之一。本研究利用自杀性载体首次成功构建了RA Th4菌株的OmpA 缺失株,为进一步研究OmpA在RA致病机制中的作用奠定基础。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-6
缩略词表  6-11
第一部分文献综述  11-29
第二部分实验内容  29-86
  第一章鸭疫里默氏杆菌血清1 型、2 型单克隆抗体的制备  29-39
    1 材料  29-31
      1.1 生物材料  29
      1.2 主要试剂  29-30
      1.3 主要试剂的配制  30-31
    2 方法  31-35
      2.1 免疫原的制备  31
      2.2 动物免疫  31
      2.3 小鼠血清效价测定及检测方法  31-32
      2.4 细胞融合  32-33
      2.5 阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化  33-34
      2.6 单克隆抗体的鉴定  34-35
    3 结果  35-37
      3.1 mAb 杂交瘤细胞株的建立  35
      3.2 mAb 生物学特性的鉴定  35
      3.3 mAb 免疫荧光的鉴定  35-36
      3.4 mAb 反应谱测定结果  36-37
    4 讨论  37-38
    5 参考文献  38-39
  第二章鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成特性的研究  39-55
    1 材料  39-41
      1.1 菌株  39-40
      1.2 试剂  40
      1.3 仪器  40
      1.4 培养基的配制  40-41
    2 方法  41-44
      2.1 RA 的分离、培养  41
      2.2 RA 分离株鉴定  41-42
      2.3 结晶紫法检测生物被膜的形成  42-43
      2.4 糖类和EDTA 对生物被膜的影响  43
      2.5 抗生素和去污剂对生物被膜形成的影响  43
      2.6 分离株CH3 的生物被膜生长曲线测定  43-44
      2.7 扫描电镜和荧光显微镜分析生物被膜的形态和结构  44
      2.8 动物试验  44
    3 结果  44-51
      3.1 R A 菌株的分离鉴定  44-45
      3.2 RA 分离株的生物被膜检测  45-46
      3.3 蔗糖、葡萄糖和EDTA 对CH3 生物被膜形成的影响  46-47
      3.4 抗生素和去污剂对生物被膜形成的影响  47-48
      3.5 生物被膜的生长曲线  48-50
      3.6 生物被膜的结构  50
      3.7 RA 分离株CH3、WJ4 和JY4 的LD50 测定  50-51
    4 讨论  51-52
    5 参考文献  52-55
  第三章鸭疫里默氏杆菌 OmpA 缺失株的构建  55-86
    1 材料  55-59
      1.1 菌株和质粒  55-56
      1.2 主要分子生物学及生化试剂  56
      1.3 培养基  56-57
      1.4 主要缓冲液及试剂配制  57-58
      1.5 主要仪器设备  58-59
    2 试验方法  59-70
      2.1 不同血清型鸭疫里默氏杆菌OmpA 基因的克隆与序列分析  59-60
      2.2 血清1 型WJ4 株鸭疫里默氏杆菌OmpA 基因的表达与多克隆抗体的制备  60-61
      2.3 不同血清型鸭疫里默氏杆菌 OmpA 蛋白与血清1 型 WJ4 株OmpA 多抗的交叉反应性  61
      2.4 鸭疫里默氏杆菌Th4 OmpA 左侧未知基因片段的克隆  61-64
      2.5 pHM5-LSR 自杀载体的构建  64-69
      2.6 Th4 OmpA 基因缺失菌株的筛选及鉴定  69-70
    3 结果和分析  70-83
      3.1 不同血清型鸭疫里默氏杆菌OmpA 基因的克隆与序列分析  70-72
      3.2 血清1 型WJ4 株鸭疫里默氏杆菌OmpA 基因的表达与多克隆抗体的制备  72
      3.3 不同血清型鸭疫里默氏杆菌 OmpA 蛋白与血清1 型 WJ4 株OmpA 多抗的交叉反应性  72-73
      3.4 鸭疫里默氏杆菌Th4 OmpA 左翼基因片段的克隆  73-75
      3.5 pHM5-LSR 自杀载体的构建  75-80
      3.6 OmpA 基因缺失菌株的筛选及鉴定  80-83
    4 讨论  83-84
    5 参考文献  84-86
全文结论  86-87
附录：攻读硕士学位期间发表的论文  87-88
致谢  88

鸭疫里默氏杆菌特异性单克隆抗体的研制以及生物被膜和OmpA缺失株的研究

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